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昼夜节律是指在生物体内存在的以近似24h为周期的生物节律,哺乳动物的生理和代谢节律受昼夜节律的控制。昼夜节律的振荡导致下游分子通路和生理过程发生节律性变化,对营养物质的消化吸收代谢有一定的调控作用。课题组前期体外培养瘤胃上皮细胞、组织试验和瘤胃上皮细胞沉默及小鼠体内敲除PER2基因试验的研究表明,PER2与瘤胃VFA吸收代谢存有一定相关性,可能存在重要的调控作用,但其中具体规律和机制尚不明了。因此,本研究结合体内外试验,通过奶山羊体内灌注VFA及瘤胃上皮细胞体外过表达PER2基因,以探究PER2对瘤胃上皮挥发性脂肪酸转运的调控机制。试验一、瘤胃VFA灌注研究瘤胃上皮节律蛋白调控VFA吸收的关系在课题组前期体外培养瘤胃上皮细胞、组织试验结果基础上,本部分在动物体内进一步探究瘤胃上皮节律蛋白调控VFA的吸收机制。试验通过对奶山羊灌注0.8 g/kg.d乙酸钠、0.8 g/kg.d丙酸钠、0.5 g/kg·d丁酸钠溶液,分别为乙酸组、丙酸组、丁酸组,另设对照组灌注等体积生理盐水。灌注期采用胃管收集瘤胃液50 ml,检测瘤胃发酵指标,灌注期结束后屠宰获取瘤胃上皮组织,用于检测瘤胃上皮组织形态学、生物钟及VFA吸收代谢相关基因的表达量。结果发现:pH值在5.90～6.73之间波动,处于瘤胃正常pH范围内,各组之间差异不显著(P>0.05)。各组NH3-N浓度呈曲线变化的趋势,NH3-N浓度在3.43～7.40mg/dL之间变动,各处理组之间NH3-N浓度差异不显著(P>0.05)。乙酸、丙酸和丁酸摩尔浓度分别在乙酸组、丙酸组和丁酸组显著高于其他三组(P<0.05);此外,PER1和PER2基因表达量在丙酸组表达量最高、丁酸组最低,且各组之间差异均显著(P<0.05);CLOCK基因的表达量受短链脂肪酸的影响,各组差异显著(P<0.05);NCOR1基因表达量生理盐水组显著高于乙酸组和丁酸组(P<0.05),与丙酸组差异不显著(P>0.05);BMAL1、CRY1、CRY2、PPARA、FBXW11均在乙酸组基因表达量最高,在丁酸组基因表达量最低,但各组之间差异不显著(P>0.05)。在PER2基因和VFA相关吸收基因表达的相关性中,生物节律基因PER2与NHE1、NHE3、Na/KATPase、PAT1基因的相对表达呈正相关(P<0.05),与MCT1、MCT4基因的相对表达呈负相关趋势(P>0.05)。综上表明,动物体内研究瘤胃上皮组织验证了PER2基因通过正向调控NHE1、NHE3、Na/KATPase、PAT1基因、负向调控MCT1、MCT4基因,调控瘤胃VFA的吸收代谢,并证实了之前试验中在体外培养瘤胃上皮、组织中发现的结果。试验二、瘤胃上皮细胞体外培养探究VFA转运相关因子表达的节律性为进一步研究瘤胃上皮节律蛋白调控VFA吸收的机制,本部分试验对VFA转运相关因子是否受节律因子的调控以及其与节律基因表达的相关性进行了探索。试验选取原代山羊瘤胃上皮细胞,研究上述VFA转运因子的日节律性。试验体外培养山羊瘤胃上皮细胞48 h,每间隔4h采集细胞样品,各个时间点6孔重复,测定节律相关因子和VFA转运相关基因表达量等的节律性。结果发现:节律调控因子PER2基因表达量在不同时间点差异显著(P<0.05),进一步对PER2基因表达量做非线性回归拟合,符合余弦函数的日节律变化,拟合余弦函数方程为YPER2=1.497+1.086*cos(x+0.359),R2=0.896。此外,PER1、PER3、BMAL1、CRY1、CRY2、NR1D1、NR2F2、NCOR1、FBXW11基因的表达量在各时间点差异显著(P<0.05)。VFA转运相关因子的基因表达量在时间点差异显著,而且部分符合余弦函数的日节律变化,拟合曲线如下:MCT4:Y=2.306+1.997*cos(x+0.743),R2=0.926;NHE1:Y=1.130+0.770*cos(x+19.383),R2=0.678;NHE3:Y=1.095+0.658*cos(x-0.678),R2=0.832;VHATPase:Y=4.386-3.024*cos(x-2.173),R2=0.664;Na/KATPase:Y=1.095+0.658*cos(x-0.678),R2=0.832。而且生物节律基因PER2与MCT4基因的相对表达呈负相关(P<0.05)。本部分结果表明,山羊瘤胃上皮细胞PER2及相关生物钟基因和VFA相关转运载体基因的表达存在近余弦函数的日节律变化规律,而且PER2基因与VFA相关基因的日节律存在一定的相关性。试验三、PER2基因过表达对瘤胃上皮细胞生长增殖及VFA吸收蛋白表达的影响基于动物体内灌注试验、VFA转运相关因子节律性探索试验的结果,本部分试验构建pcDNA3.1-PER2质粒,体外培养山羊瘤胃上皮细胞,过表达PER2基因,设对照组(pcDNA3.1)和过表达组(pcDNA3.1-PER2),每组4个生物学重复。测定细胞增殖、凋亡、周期规律,细胞抗氧化指标,生物钟相关基因和VFA转运蛋白基因及相关调控因子的表达。结果显示,pcDNA3.1-PER2质粒转染48 h后,PER2基因的相对表达量为4061.63,过表达组PER2基因的过表达量是对照组的3471.48倍,极显著高于对照组(P<0.01),表明山羊PER2基因过表达成功,为后续的试验提供了可靠的试验基础。过表达后,细胞的凋亡水平显著升高(P<0.05);过表达组在转染后的24 h和48 h的增殖活性均显著低于对照组(P<0.05),表明过表达抑制了瘤胃上皮细胞的增殖。PER2基因过表达显著增加了CCND1、WEE1、P21、P16基因的表达量(P<0.05),而显著降低了 CDK4基因的表达量(P<0.05)。过表达PER2基因后,细胞内炎症基因的表达无显著性变化(P>0.05),但TNF-α的表达量有明显增加的趋势。与对照组相比,过表达组山羊瘤胃上皮细胞内SOD、MDA、GSH-PX、CAT、T-AOC均无显著变化,说明过表达PER2基因对山羊瘤胃上皮细胞未产生氧化损伤。而且,PER2过表达显著下调了AE2、NHE1、MCT1、MCT4基因mRNA表达量,上调PAT1、VH+ATPase基因mRNA表达量。本部分结果表明,PER2基因的过表达抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,同时,证实了PER2基因对瘤胃上皮VFA转运相关因子的调控。综上,PER2基因可能通过调控VFA吸收转运蛋白调控瘤胃上皮细胞VFA的吸收,其具体调控通路机制有待进一步深入研究。