论文部分内容阅读
轴索损害是多发性硬化(multiple sclerosis, MS)最早期及进展严重的表现,是MS永久残疾的重要病理决定因素。MS患者脱髓鞘斑形成的早期即可出现β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein ,β-APP)积聚,而β-APP积聚被认为是轴索损害的一个特征性标志,表明在患者脱髓鞘的同时轴索也受到损伤,轴索损伤后,启动了来自髓鞘成分的轴索生长抑制作用,其核心部分是轴索生长抑制转导通路。轴索生长抑制因子Nogo蛋白受体(Nogo receptor,NgR)是轴索生长抑制转导通路最重要的递质受体之一,NgR位于细胞膜上,介导神经轴索生长抑制的跨膜信号。本研究通过观察β-APP蛋白,及NgRmRNA在MS的实验模型-实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)大鼠模型中的表达情况,以了解轴索损伤及神经轴索生长抑制通路在EAE不同病理过程中的参与及其可能的作用机制,初步探讨EAE动物模型发病过程中,轴索损伤与神经轴索生长抑制通路可能的相互关系及对EAE病理过程的影响及机制。【材料与方法】分EAE大鼠模型致敏8天A组,发病高峰期B组,35天组C组,均采用相同剂量及相同方法制作的新鲜豚鼠脑脊髓白质匀浆制成诱导乳剂,诱导建立EAE动物模型,空白对照D组动物致敏当天仅双后足垫皮下注射生理盐水及免疫佐剂。对致敏动物进行持续的行为学观察,按时间要求进行各期的临床症状评分;用HE染色、轴索银染、尼氏染色、砂罗铬花青染色(髓鞘)染色等方法观察病理改变;免疫组化观察β-APP的表达及原位杂交法测定NgRmRNA的表达;最后用Adobe Photoshop CS3 10.0、ImageJ 1.37v和SPSS16.0等软件处理分析结果。【结果】1、动物模型建立的与检验本实验中各实验组Lewis大鼠最早在免疫后第16天出现尾部无力,至第20天全部动物发病。在免疫后第21天动物的临床症状达到高峰期,约于致敏后35天恢复完全,对照组动物无一发病。形态学观察也发现了典型的EAE病理改变:弥漫的炎症细胞浸润,特征性的血管“袖套”样改变,神经元的变性、水肿,片状髓鞘脱失、轴索脱失。2、EAE各病理阶段β-APP的表达非参Kruskal-Wallis Test检验结果显示:统计量卡方值χ2=79.60,df=3,渐进概率(Asymp. Sig.)p<0.001,表明4组间总的β-APP阳性表达有显著统计学差异;Dunnet’s T Test组间多重比较显示:D组的β-APP灰度显著高于其他三组; A组与C组间比较P=0.397,差异无统计学意义;其余A组与B组,B组与C组的β-APP灰度比较均为p<0.01,组间差异有统计学意义。从时间轴角度观察,β-APP的表达自动物致敏开始逐渐下降,在发病高峰期强度最弱,其后随EAE的发病进入恢复和慢性阶段,β-APP的表达逐渐升高。3、EAE各病理阶段NgRmRNA的表达NgRmRNA在大鼠脑组织中的表达的结果经Kruskal-Wallis Test统计检验显示:统计量卡方值χ2=11.56,df=3,渐进概率(Asymp. Sig.)p=0.009<0.01,表明4组间NgRmRNA表达的差别有统计学意义;Dunnet’s T Test的组间多重比较结果显示:A,B,C三个EAE模型组与D组空白对照组之间的差异显著,p=0.002<0.05,表明D组的NgRmRNA灰度显著低于其他三组;A组与B组间NgRmRNA灰度均数比较P=0.055, A组与C组比较P=0.049,组间差异明显,B组与C组比较p=0.975,组间差异无统计学意义。从时间轴的角度观察,NgRmRNA表达自动物致敏开始逐渐升高,在早期炎症浸润时表达最强,后逐渐下降至EAE的发病高峰期表达水平最低,维持至进入恢复和慢性阶段。4、EAE模型中β-APP和NgRmRNA表达的相关性两者间的直线相关检验结果显示:β-APP和NgRmRNA的表达在EAE的整个发病过程中呈负相关关系,Pearson直线相关检验的相关系数为r = -0.207,P<0.05,两者的负相关关系具有明显的统计学意义。【结论】1、轴索损伤是EAE病理过程中的重要改变,主要表现为EAE高峰期片状轴索脱失,轴索损伤,以后随EAE的病理进展有下降趋势可能与模型的临床表现有一定的因果关系;2、此实验中轴索损伤的形态学表现和β-APP蛋白的表达并不一致,提示β-APP蛋白的表达受EAE发病过程中多因素的影响,可能包括炎症细胞浸润;3、NgRmRNA的表达随EAE病情的进展表达发生改变,从早期的炎症浸润阶段就开始升高至峰值,此后降低,并维持至慢性恢复阶段,提示NgRmRNA的表达可能与早期的轴索损伤相关;4、β-APP与NgRmRNA的表达在EAE的病理进展过程中呈一定的负相关关系,这可能表明在EAE模型中,急性轴索损伤并不是激活轴索再生抑制通路的关键因素,而是其他因素在起作用,包括炎症浸润,脱髓鞘改变等。