目的:锰（Manganese,Mn）是维持机体正常生长、发育和细胞内环境稳态所必需的一种普遍存在的微量元素,是体内许多重要酶和稳态路径的关键辅助因子。长期和过度的锰暴露会引起大脑的病理改变,尤其是纹状体、苍白球和黑质,且会伴随着多巴胺能神经元的丢失,我们称之为锰中毒。已有研究表明,线粒体功能障碍也是锰神经毒性的重要机制之一。线粒体作为细胞质内重要的细胞器之一,可以调控生物体内许多重要的生理过程。同时,线粒体也是细胞内主要的能量来源,它供给了几乎所有类型的细胞活动所需要的能量。因此,锰的神经毒性很可能与神经元线粒体损伤密切相关。白藜芦醇（Resveratrol,Rsv）是一种存在于葡萄、浆果和红酒等中的天然多酚类化合物,具有抗氧化、抗炎和抗癌等多种功效。多项研究显示,白藜芦醇可以通过血脑屏障,对神经系统发挥保护作用。且已有研究证明,线粒体是白藜芦醇的关键下游目标,可以通过调控线粒体氧化磷酸化、减少线粒体活性氧（mt ROS）的产生等方式调控线粒体功能。然而,目前关于白藜芦醇保护锰诱导的线粒体生成障碍的研究很少。沉默信息调节因子3（Sirtuin 3,Sirt3）,位于线粒体中,是主要的线粒体NAD+依赖性去乙酰化酶,且在维持线粒体活力方面发挥着关键作用。因此,我们推测Sirt3对于缓解锰诱导的线粒体功能障碍非常重要。本研究以原代培养神经元为研究对象,并予以适宜剂量的锰处理构建神经元细胞损伤模型,通过分析线粒体损伤和线粒体生成的关系,揭示白藜芦醇通过促进线粒体生成缓解锰诱导的线粒体损伤以及生成障碍的具体分子机制,为锰诱发神经毒性的机制研究提供实验依据。研究方法:体外培养从野生型C57BL/6新生小鼠中分离的原代神经元,经神经元特异性抗体染色,免疫荧光鉴定阳性率在90%以上可进行后续实验。首先,将原代神经元用0,50,100,200,400μM锰分别处理0,6,12,18和24小时,分别测定CCK8（Cell Counting kit-8）和乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）释放量,以检测神经元活力和细胞毒性。根据以上实验结果,最终选择100,200μM为最终染毒浓度,并将24小时定为最终染毒时间。此外,原代神经元在分别用0,5,10,20μM白藜芦醇预处理2小时后加入200μM锰处理24小时,然后检测CCK8和LDH释放量,以确定白藜芦醇的最佳干预剂量。为了检测锰的神经毒性以及白藜芦醇的保护作用,我们将实验分组分为空白对照组（培养液）,锰处理组（100,200μM锰）,白藜芦醇对照组（20μM白藜芦醇）和白藜芦醇预处理组（10μM白藜芦醇和200μM锰,20μM白藜芦醇和200μM锰）。此外,为了验证Sirt3在缓解线粒体生成障碍中的重要性,我们予以Sirt3 si RNA（si-Sirt3）干扰Sirt3的表达,并检测了CCK8和LDH释放量以确保其不会造成细胞损伤,最终确定实验分组分别为空白对照组（Control si RNA）,锰处理组（Control si RNA+200μM锰）,白藜芦醇预处理组（Control si RNA+20μM白藜芦醇+200μM锰）,Sirt3 si RNA对照组（Sirt3 si RNA）,Sirt3 si RNA锰处理组（Sirt3 si RNA+200μM锰）,Sirt3 si RNA和白藜芦醇预处理组（Sirt3 si RNA+20μM白藜芦醇+200μM锰）。流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体活性氧和线粒体膜电位;化学发光法检测ATP水平;多功能酶标仪检测Sirt1和Sirt3的酶活性;Real time-q PCR技术检测线粒体DNA拷贝数;免疫沉淀技术（Immunoprecipitation,IP）检测检测PGC-1α和TFAM的乙酰化水平;染色质免疫沉淀反应（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）检测PGC-1α和Sirt3启动子的相互作用;反转录定量PCR技术（Reverse transcription-q PCR,RT-q PCR）检测Sirt3、Sirt1、PGC-1α、NRF-1、TFAM以及GAPDH的m RNA水平;免疫印记技术检测线粒体细胞色素C、Sirt1、cleaved caspase-3、Sirt3、Bax、acetylated lysine、Bcl-2、PGC-1α、NRF1、TFAM、VDAC和β-actin的蛋白水平。结果:随着染锰剂量的增加（0-400μM）及时间的延长（0-24h）,神经元细胞活力不断下降且细胞毒性逐渐增加,呈剂量-时间依赖效应关系。鉴于在染锰剂量为100μM和200μM时,最有利于后续实验的毒性判断,故选择这两个剂量为最终染毒剂量。同时,因为10μM和20μM白藜芦醇预处理能有效缓解200μM锰诱导的细胞活力下降及细胞毒性增加,故将其作为最终干预剂量。与空白对照组相比,100μM和200μM锰处理明显增加神经元细胞的凋亡率、线粒体损伤以及线粒体网路碎片化;此外,100μM锰处理明显促进线粒体生成,增加Sirt1和Sirt3的酶活性、m RNA和蛋白水平,以及促进PGC-1α蛋白与Sirt3启动子的相互作用,并减少了PGC-1α的乙酰化水平;而200μM锰处理则明显抑制了线粒体生成,降低Sirt1和Sirt3的酶活性、m RNA和蛋白水平,抑制PGC-1α蛋白与Sirt3启动子的相互作用,且明显增加了PGC-1α的乙酰化水平。与200μM锰处理相比,10μM和20μM白藜芦醇预处理能明显缓解200μM锰处理诱导的细胞凋亡、线粒体损伤以及线粒体网络碎片化;同时,20μM白藜芦醇预处理也明显缓解了200μM锰对线粒体生成的抑制,增加了Sirt1和Sirt3酶活性、m RNA和蛋白水平,PGC-1α蛋白与Sirt3启动子的相互作用,并降低了PGC-1α的乙酰化水平。此外,si-Sirt3干扰Sirt3表达后,有效降低了Sirt3的m RNA和蛋白表达。与si-Control转染组相比,si-Sirt3转染组中的Sirt3酶活性明显降低,且200μM锰处理也明显增加了TFAM的乙酰化水平,并明显抑制了线粒体生成;而20μM白藜芦醇预处理并没有明显的缓解作用。结论:白藜芦醇可以通过部分激活Sirt1/PGC-1α和Sirt3,促进线粒体生成,进而缓解锰诱导的原代神经元细胞损伤以及线粒体功能障碍。