论文部分内容阅读
目的:
克隆人IgGlFc段(hIgGlFc)基因,构建pET32a(+)-mGITRaa22-153-HIgGlFc原核表达载体,并在体外表达、纯化mGITRaa22-153-hIgGlFc(GITR-Fc)融合蛋白;建立小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,观察GITR-Fc蛋白对CIA发病的影响,并寻找其作用机制。
方法:
(1)采用PCR的方法,扩增MgGlFc基因,连接至PMD-18T载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定。用酶切方法从阳性T-A克隆中获得hIgGlFc基因,连接至pET32a(+)-mGITRaa22-153(由本实验室保存)质粒和pET32a(+)质粒,并转化至EcoliDH5a宿主菌,选择阳性菌落进行增菌,抽提质粒,并进行酶切和PCR鉴定。将重组质粒pET32a(+)-mGITRaa22-153-hIgGlFc和pET32a(+)-hIgGlFc分别转化E.ColiRosetta宿主菌,通过PCR和酶切鉴定阳性菌株,经0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导蛋白表达,表达蛋白经Profinity IMAC Nickel柱纯化、去除内毒素,并通过Western blot进行鉴定。
(2)取等体积0.2g/L鸡Ⅱ型胶原(CⅡ)与弗氏完全佐剂1∶1混合,充分研磨至混合物完全乳化,取乳化后的CH于小鼠(100μgCⅡ/只)尾根部皮内注射。第一次免疫当日为0天,于免疫后第21天用CⅡ与弗氏不完全佐剂的乳化物加强免疫,建立CIA模型。将模型小鼠随机分为CIA模型组(CIA)、CIA-目的蛋白组(CIA-GITR-Fc)和CIA-对照蛋白组(CIA-Fc)。于免疫第18天时,通过尾静脉分别注射80μg GITR-Fc蛋白及80μg对照蛋白,观察小鼠发病进程(临床评分,CIA发病率,病理学检查等);利用流式细胞术检测小鼠脾脏中Tfh细胞和B细胞的比例、数目变化;利用ELISPOT检测脾脏和骨髓中抗CⅡ特异性抗体分泌细胞的变化。
结果:
(1)成功构建pET32a(+)-mGITRaa22-153-hIgGlFc重组质粒和pET32a(+)-hIgGlFc重组质粒,经PCR和双酶切鉴定分别可见在1461bp和1047bp位置处出现条带,并且测序结果与mGITRaa22-153基因和hIgGlFc基因序列完全一致。
(2)将阳性克隆载体转化E.coli Rosetta宿主菌,确定终浓度1.5mmol/LIPTG,温度25℃,诱导时间6h为最佳诱导条件,通过Profinity IMAC Nickel柱纯化目的蛋白纯度＞90%,获得原核表达的GITR-Fc蛋白和hIgGlFc(Fc)蛋白,相对分子质量大小分别为72KD、56KD。所得蛋白经Western blot鉴定为GITR-Fe蛋白和Fc蛋白。
(3)成功建立小鼠CIA模型,关节炎发病率为80%。在关节炎模型第45天时,GITR-Fc组小鼠的关节炎发病率(27%)明显低于对照蛋白组(100%)和CIA组(80%);病理学检查发现GITR-Fc组小鼠关节滑膜炎性细胞的浸润及骨的侵蚀较对照蛋白组和CIA组明显减轻。ELISPOT检测发现与对照蛋白组和CIA组相比,GITR-Fc组脾脏中抗CⅡ特异性抗体分泌细胞数目明显下降,结果有显著差异(P＜0.01);与对照蛋白组和CIA组相比,GITR-Fc组骨髓中抗CⅡ特异性抗体分泌细胞数目明显下降,有显著差异(P＜0.05)。流式细胞术检测发现,与对照蛋白组和CIA组相比,GITR-Fc蛋白组小鼠脾脏中B细胞比例(53.86±18.01%)明显降低,有显著差异(P＜0.05);与对照蛋白组和CIA组相比,GITR-Fc蛋白处理组小鼠脾脏中Tfh细胞比例(1.39±0.84%)明显减少,有显著差异(P＜0.05);同时根据计算发现,GITR-Fc蛋白组小鼠脾脏中Tfh细胞数目(2.20×105±1.14×105)明显下降,有显著差异(P＜0.05)。
结论:
(1)成功成功构建pET32a(+)-mGITRaa22-153-hIgGlFc表达载体,并获得原核表达的GITR-Fc融合蛋白;
(2)GITR-Fc蛋白可以降低CIA小鼠关节炎的发病严重程度,并且这种作用可能是通过下调Tfh细胞和抗CⅡ特异性抗体分泌细胞的数目有关。