位于血管壁中膜的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在维持血管内环境、血压、损伤应答中起着至关重要的作用。VSMC表型转换、增殖和迁移是动脉粥样硬化、血管成形术以及PCI术后再狭窄等血管重塑性疾病的共同病理学基础。阐明VSMC表型转化机制对防治血管重塑性疾病具有重要意义。表观遗传学调节在VSMC表型调制中发挥重要作用。既往研究已经证明,全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)通过诱导VSMC标志基因启动子周围的组蛋白H4乙酰化和组蛋白H3K4二甲基化(H3K4dime),从而促进VSMC基因表达及细胞分化。组蛋白乙酰转移酶(HAT)CBP和p300通过催化组蛋白乙酰化而导致染色质去稳定与相关转录因子一起共同激活VSMC标志基因表达。我室前期研究已经证明,p300对ATRA诱导VSMC分化和组蛋白乙酰化是必需的,但目前尚不清楚p300如何定位到VSMC标志基因的启动子上。Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)属于含锌指结构的转录因子家族重要成员,主要参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞周期以及胚胎发育等的调节。前期研究发现,KLF4在VSMC分化中发挥重要作用。KLF4的N端含有较强的转录激活域,能募集CBP/p300到靶基因,如小肠碱性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase,IAP)特定的DNA结合位点,促进组蛋白乙酰化。然而,KLF4能否将p300募集到VSMC标志基因启动子中的KLF4结合位点上并使周围的组蛋白乙酰化目前尚待阐明。为了阐明KLF4是否可以募集p300并进而介导组蛋白乙酰化以及其分子机制,本研究用转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)诱导VSMC分化,探索KLF4与p300、PTEN等蛋白因子相互作用及其翻译后修饰的变化,研究KLF4与组蛋白乙酰化之间的关系,从表观遗传学角度揭示VSMC表型调制及分化的新机制。第一部分KLF4介导TGF-β1诱导的组蛋白H3乙酰化目的:观察TGF-β1是否促进组蛋白乙酰化,以及KLF4在组蛋白乙酰化中所起的作用。方法:Western blot检测组蛋白H3和H4的乙酰化;细胞免疫荧光观察TGF-β1对组蛋白H3和H4乙酰化的影响;Ch IP法检测乙酰化H3、p300和KLF4在p21、TβRI启动子上的富集。结果：1 TGF-β1促进组蛋白H3、H4乙酰化组蛋白乙酰化与基因转录激活密切相关,TGF-β1调节血管平滑肌细胞分化和细胞周期相关基因的表达。Western blot结果和细胞免疫荧光染色结果显示,给予TGF-β1孵育细胞不同浓度(0、1、2、4 ng/m L)和不同时间(0、3、6、12、24 h),组蛋白H3和H4的乙酰化水平增高。转录因子KLF4的表达也与TGF-β1刺激呈时间和剂量依赖性的增加。2 KLF4介导TGF-β1诱导的组蛋白H3乙酰化分别用Ad-KLF4和si-KLF4转染VSMC,在VSMC中过表达KLF4或敲低KLF4的基础上,检测TGF-β1对H3和H4乙酰化的影响。Western blot分析结果显示,过表达KLF4后,组蛋白H3的乙酰化水平明显升高,TGF-β1处理进一步促进H3的乙酰化。敲低内源性KLF4后,组蛋白H3的乙酰化水平降低,TGF-β1对H3的乙酰化水平不再产生影响;但组蛋白H4的乙酰化水平不受KLF4过表达或敲低的影响。结果表明,KLF4是TGF-β1诱导组蛋白乙酰化所必须的。3 KLF4促进乙酰化型组蛋白在分化相关基因启动子区域富集p21是KLF4的靶基因,KLF4激活p21基因表达是否与p21启动子周围的组蛋白乙酰化有关呢?为了明确这一问题,我们以p21基因启动子作为研究对象,用染色质免疫沉淀(Ch IP)分析KLF4与组蛋白乙酰化的关系。我们分别用KLF4腺病毒表达载体或靶向敲低KLF4的si RNA转染VSMC,给予或不给予TGF-β1刺激12 h。Ch IP结果显示,在过表达KLF4的细胞中,乙酰化型H3水平在1.5 kb的p21启动子区域均有不同程度的增高,但以-645bp到+57 bp区域乙酰化型H3富集较为明显,-227 bp/+57 bp区域乙酰化型H3的富集程度最大。这一区域含有KLF4的结合位点。在敲低KLF4的细胞中,该区域乙酰化型H3的富集程度降低。这些结果表明,KLF4介导组蛋白H3的乙酰化并促进乙酰化H3在p21启动子区域的富集。4 KLF4促进p300在分化相关基因启动子区域富集Ch IP实验结果显示,TGF-β1增强p300在p21启动子区域的结合,其结合位点主要定位于-645 bp/-397 bp和-225 bp/57 bp区域,这两个区域分别包含Smad和KLF4的结合位点。进一步研究发现,p300结合受KLF4的调节,在过表达KLF4的基础上,再用TGF-β1刺激细胞12 h,p300在这两个区域的结合进一步增加。靶向敲低KLF4后,p300在此区域的富集降低。结果表明,KLF4可以将p300募集到转录因子结合位点上发挥组蛋白乙酰基转移酶的作用。小结：KLF4可以将p300募集到VSMC分化相关基因启动子区转录因子结合位点上,并促进TGF-β1诱导的组蛋白H3乙酰化。第二部分p300、PTEN通过与KLF4相互作用,影响其乙酰化及磷酸化目的:检测TGF-β1是否影响KLF4与乙酰化酶p300、磷酸酶PTEN的相互作用。观察p300、PTEN对KLF4修饰状态的影响。方法:免疫共沉淀检测KLF4与p300、PTEN的相互作用;细胞免疫荧光观察TGF-β1是否诱导KLF4和p300入核;Sequential-Ch IP法检测p300和KLF4在p21启动子上的结合方式;GST pull-down体外验证KLF4与p300、PTEN的相互作用。结果：1 TGF-β1促进KLF4与p300的相互作用,抑制KLF4与PTEN的相互作用免疫共沉淀和GST pull-down实验结果显示,TGF-β1刺激VSMC 30min,KLF4与p300的结合达到高峰,在60 min时基本降到基础水平。同时发现,在基础水平上,KLF4与PTEN结合形成复合物,TGF-β1刺激导致KLF4与PTEN的解离。在TGF-β1刺激细胞30 min时,两者的结合降到最低,60 min时,KLF4和PTEN的结合恢复到基础水平。以上结果表明,TGF-β1促进KLF4和p300的相互作用,抑制KLF4与PTEN的相互作用。2 TGF-β1促进KLF4和p300入核后结合到p21启动子上细胞免疫荧光染色结果显示,在静止的VSMC中,KLF4在胞浆胞核均有分布,但以胞浆居多。TGF-β1刺激30 min后,KLF4出现核转位,几乎完全定位于细胞核中。p300和KLF4的变化趋势一致。说明KLF4与p300很有可能在TGF-β1刺激下,共同入核发挥作用。我们进一步进行了sequential Ch IP实验,结果显示,TGF-β1刺激后,KLF4-p300复合物结合到p21启动子的-225 bp/57 bp区域。KLF4腺病毒表达载体感染VSMC,进一步增加p21启动子的-225 bp/57 bp区域KLF4与p300的相互作用。综上所述,在TGF-β1作用下,KLF4通过与p300相互作用,将其募集到p21等分化基因启动子区域的KLF4结合位点上。3 TGF-β1诱导KLF4磷酸化和乙酰化免疫沉淀结果显示,在TGF-β1作用下,KLF4的磷酸化水平增高,在30 min时达到高峰,60 min基本恢复到基础水平。在相同实验条件下,KLF4的乙酰化水平亦呈时间依赖性增加,在45 min达到高峰,TGF-β1作用60min仍维持在较高水平上。4 p300和PTEN影响KLF4的乙酰化和磷酸化由于p300和PTEN均能与KLF4相互作用,那么p300和PTEN是否影响KLF4的乙酰化和磷酸化呢?利用靶向敲低p300的si RNA转染VSMC,免疫沉淀结果显示,p300可使KLF4乙酰化。分别用GFP-PTEN和si-PTEN转染VSMC,在VSMC中过表达或敲低PTEN的基础上,检测TGF-β1对KLF4磷酸化的影响。免疫沉淀结果显示,过表达PTEN后,KLF4磷酸化水平显著被抑制,TGF-β1不再能促进KLF4磷酸化。敲低内源性PTEN后,KLF4磷酸化水平增高,TGF-β1处理可进一步增加KLF4的磷酸化水平。同时,我们利用VMSC特异性缺失PTEN的小鼠,取其主动脉,提取总蛋白进行免疫沉淀。结果显示,PTEN-/-小鼠主动脉中KLF4的磷酸化水平明显高于WT小鼠。上述结果从正反两方面证明,PTEN可以直接去磷酸化KLF4。小结：在基础水平上,PTEN与KLF4形成复合物抑制KLF4的磷酸化,TGF-β1刺激后,PTEN与KLF4解离,PTEN不再能去磷酸化KLF4,进而KLF4转为与p300相互作用,将募集p300到p21等分化相关基因的启动子KLF4结合位点上。第三部分磷酸化型KLF4通过p38信号通路影响p300乙酰化,进而介导组蛋白H3乙酰化目的:研究KLF4的磷酸化修饰是否参与组蛋白H3的乙酰化及作用机制。方法:转染KLF4磷酸化、乙酰化位点突变体表达质粒,观察与KLF4相互作用的相关蛋白的修饰状态的改变;Western blot检测相关信号通路的变化;si RNA转染实验用于在VSMC中敲低KLF4;免疫沉淀实验检测KLF4磷酸化和乙酰化状态的变化。结果：1 KLF4磷酸化影响其与p300的相互作用及自身的乙酰化前期研究证明,TGF-β1通过激活Smad和p38 MAPK信号通路促进KLF4的Ser470残基磷酸化,从而影响KLF4与Smad的相互作用,那么KLF4Ser470磷酸化是否影响KLF4与p300的相互作用。我们分别用KLF4表达质粒GFP-KLF4和KLF4丝氨酸位点突变体(S470A)表达质粒转染细胞,并进行免疫共沉淀实验。结果显示,转染GFP-KLF4(S470A)表达质粒后,KLF4的Ser470的位点不能被磷酸化,即使给予TGF-β1刺激,KLF4与p300的相互作用也处于较低水平。而KLF4与PTEN不受影响,给予TGF-β1刺激后两者还是处于解离状态。在相同实验条件下,我们检测KLF4的乙酰化状态是否发生变化。结果显示,转染KLF4突变体(S470A)后,给予TGF-β1孵育细胞30 min,KLF4的乙酰化水平与GFP-KLF4(WT)转染+TGF-β1组相比显著下降。转染KLF4乙酰化位点的突变体表达质粒(K225R、K229R和K225/229R)48 h后,给予TGF-β1刺激30 min,结果显示,KLF4的磷酸化水平与KLF4(WT)+TGF-β1组相比没有明显区别。以上结果表明,VSMC被TGF-β1刺激后,KLF4发生磷酸化在前,乙酰化在后;磷酸化型KLF4影响KLF4与p300相互作用,但不影响KLF4与PTEN的相互作用,这意味着KLF4与PTEN的解离在先,KLF4与p300相互作用在后。2 KLF4的磷酸化影响组蛋白H3乙酰化上述结果显示,过表达KLF4可增加组蛋白H3的乙酰化水平,那么是否KLF4的磷酸化也影响组蛋白乙酰化呢?我们分别用KLF4(WT)、KLF4(S470A)、KLF4(K225R)、KLF4(K229R)和KLF4(K225/229R)表达质粒转染细胞,Western blot分析结果显示,转染KLF4(WT)后,给予TGF-β1孵育12 h,组蛋白H3的乙酰化水平明显增高,在KLF4(S470A)转染+TGF-β1处理的细胞中,乙酰化型H3水平明显降低。但是KLF4(K225R)+TGF-β1、KLF4(K229R)+TGF-β1和KLF4(K225/229R)+TGF-β1组的乙酰化水平没有受到影响。我们也检测了p300对组蛋白H3乙酰化的影响,用p300乙酰化酶抑制剂Garcinol孵育细胞后,乙酰化型H3水平显著降低。这些结果表明,KLF4磷酸化对组蛋白H3乙酰化的影响很有可能是通过募集p300来实现的的。3 KLF4磷酸化影响p300乙酰化Western blot分析结果显示,TGF-β1作用于细胞15 min,PTEN的磷酸化显著增加,在30 min达到高峰,60 min后PTEN的磷酸化恢复到基础水平,与KLF4的磷酸化变化趋势一致。在相同实验条件下,我们也检测了p300乙酰化修饰状态的变化。结果显示,TGF-β1刺激使p300乙酰化水平呈时间依赖性增加,与KLF4的乙酰化变化趋势一致。那么KLF4磷酸化是否影响p300乙酰化呢?转染KLF4(WT)后,给予TGF-β1孵育30 min,PTEN的磷酸化和p300乙酰化水平均增高,KLF4(S470A)+TGF-β1使p300的乙酰化水平明显降低,对PTEN的磷酸化没有影响。而KLF4(K225R)+TGF-β1、KLF4(K229R)+TGF-β1和KLF4(K225/229R)+TGF-β1处理对p300乙酰化没有影响。可见,KLF4的磷酸化会正反馈调节p300的乙酰化水平。4 Smad和p38信号通路影响p300与KLF4的修饰状态我们进一步检测了TGF-β1对有关信号通路的影响。用TGF-β1刺激给予VSMC不同时间(0、15、30、45、60 min),提取总蛋白进行Western blot分析。结果显示,TGF-β1可以诱导p38、JNK、Smad2和Akt的快速磷酸化,而ERK的磷酸化水平降低。同时,而各组细胞中p38、JNK、Smad2、Akt和ERK的总量没有发生变化。在给予TGF-β1处理细胞之前,用上述信号通路的特异性抑制剂预孵育细胞2 h,经免疫沉淀和Western blot分析各蛋白的翻译后修饰状态的改变。结果显示,TGF-β1通过p38 MAPK和Akt信号通路影响PTEN的磷酸化;通过Smad和p38 MAPK信号通路影响KLF4的磷酸化、乙酰化和p300的乙酰化。证实TGF-β1通过Smad和p38 MAPK信号通路诱导KLF4磷酸化是p300乙酰化所必需的。5 KLF4通过p38信号通路影响p300乙酰化我们也检测了KLF4影响p300乙酰化的信号通路。Western blot结果显示,KLF4过表达可增加p38的磷酸化,但是不影响Smad的磷酸化水平。敲低KLF4可以部分抑制p38的磷酸化。这就从正反两方面证明了,KLF4可能通过p38信号通路促进p300的乙酰化。小结：TGF-β1通过激活p38和Smad信号通路诱导KLF4磷酸化,进而促进KLF4与p300相互作用及KLF4乙酰化。同时,KLF4也可通过间接激活p38信号通路诱导p300乙酰化,进而促进组蛋白H3的乙酰化。结论：1 KLF4可以将p300募集到VSMC分化相关基因启动子区转录因子结合位点上,并促进介导TGF-β1诱导的组蛋白H3乙酰化。2在基础水平上,PTEN与KLF4形成复合物抑制KLF4的磷酸化,TGF-β1刺激后,PTEN与KLF4解离,进而KLF4转为与p300相互作用,将募集p300到p21等分化相关基因的启动子KLF4结合位点上。3 TGF-β1通过激活p38和Smad信号通路诱导KLF4磷酸化,进而促进KLF4与p300相互作用及KLF4乙酰化。4 KLF4也可通过间接激活p38信号通路诱导p300乙酰化,进而促进组蛋白H3的乙酰化。