组织工程皮肤在顽固性溃疡及小面积创面方面都取得了较好的疗效,但遗憾的是由于缺乏皮肤附属器,使得组织工程皮肤同正常皮肤在形态、功能、质地等方面仍然有一定差距。毛囊是皮肤重要的附属器,不仅具有美容作用,还参与皮肤的生理代谢、防御、自我更新等。毛乳头位于毛囊底部,对毛囊的形成、发生发育、生长周期调控等方面均有至关重要的作用,并且研究表明毛乳头细胞的毛囊诱导能力与其凝集性生长特性密切相关。毛囊的体内诱导试验较易成功,但其体外诱导却未取得突破,其中最重要的原因是毛囊形成不仅需要上皮和间质细胞的相互作用,同时还需要一个适宜的微环境。在体内,血液的流动为毛囊的发育提供了一个由信号分子、激素和细胞外基质等组成并相互作用的微环境,这种复杂的微环境很难在体外模拟。随着灌注培养技术的应用,体内循环系统的营养供应、机械力作用、分子渗透等可以在一定程度上被模拟。本研究中,拟分离培养大鼠触须部毛乳头,建立了毛乳头细胞凝胶球的三维培养方,并利用灌注培养装置进行含毛乳头细胞凝胶球的组织工程皮肤的灌注培养,对毛囊的体外诱导进行初步探索。目的:1.分析对比显微解剖胶原酶联合分离法与两步酶消化法分离培养大鼠触须部毛乳头的效果,从而建立高效、快捷、简便分离大鼠触须部毛乳头的方法。2.创建胶原凝胶法以构建富含细胞外基质的三维毛乳头细胞凝胶球,探讨适宜的体外毛乳头重建方式,并恢复高代毛乳头细胞的凝集性生长特性。3.制备含有毛乳头细胞凝胶球的双层组织工程皮肤,在灌注式生物反应器中进行动态培养,观察体外毛囊诱导情况。方法:1.采用显微解剖胶原酶联合分离法与两步酶消化法,分别进行SD大鼠触须部毛乳头的分离及传代培养,观察比较毛乳头收获率、形态、类型、贴壁时间、操作效率等,并进行统计学分析;2.选用鼠尾胶原制成的胶原凝胶为支架材料,采用不同凝胶量及不同细胞量组合构建三维毛乳头细胞凝胶球,探讨适宜的体外重建毛乳头的方式,观察不同组合成球的时间、大小、形态;3.分别采用1代及6代毛乳头细胞构建凝胶球,比较其活力,通过α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、多能蛋白聚糖(versican)免疫荧光染色检测毛乳头细胞凝胶球的凝集性及毛囊诱导力;4.运用两步酶消化法分离培养人的角质形成细胞(keratinocyte,KC)、成纤维细胞(fibroblast,Fb)并传代培养,制备含有毛乳头细胞凝胶球的组织工程双层皮肤,在灌注式生物反应器中进行动态培养,并与静态对比,10天后取材进行HE染色,对比观察组织结构变化情况。结果:1.显微解剖胶原酶联合分离法和两步酶消化法都能获得完整毛乳头,两步酶消化法操作时间短,获得的毛乳头数量多,包括触须型和触须部被毛毛乳头;而显微解剖胶原酶联合分离法获得的毛乳头数量较少,纯度较高;但两种方法获得的毛乳头在贴壁时间、细胞迁出时间上无显著性差异;2.创建的胶原凝胶法能成功构建三维毛乳头细胞凝胶球;3.获得的凝胶球形态均为圆形或椭圆形,直径在200-1250μm大小不等;细胞数与凝胶量的多少,均能对成球直径产生影响,且有交互作用;在探索的实验条件中,100μl凝胶+105个细胞情况下得到的成球直径预测值最小,为352μm;随着细胞量的减少、凝胶量的增多,凝胶球直径有逐渐增大的趋势。4.将1代及6代毛乳头细胞构成的凝胶球移出到新的培养板后可观察到1代毛乳头细胞凝胶球周边可见完整毛乳头细胞凝集性生长的细胞团,而6代DPCs凝胶球可见单个毛乳头细胞呈放射状迁出;5.1代和6代毛乳头细胞凝胶球α-SMA、versican免疫荧光检测均为阳性;而二维培养的6代毛乳头细胞α-SMA、versican免疫荧光检测为阴性;6.灌注式生物反应器中培养的组织工程皮肤,10天后取材行HE染色显示,表皮真皮结构较静态培养的层次更为清晰,表皮层未见角化过度或脱落;7.相比于静态培养,在灌注培养中,毛乳头细胞凝胶球与人Fb、KC构建的组织工程皮肤契合更佳;并且在凝胶球上方可见表皮下陷,形成类似“毛芽”样结构。结论：两步酶消化法是一种方便、快捷、高效率的分离大鼠触须部毛乳头的方法;胶原凝胶法是体外重建毛乳头的有效方法,并且能够使高代的毛乳头细胞部分恢复凝集性生长特性及毛囊诱导能力;灌注式生物反应器较静态培养更适合于组织工程皮肤的培养,含有毛乳头细胞凝胶球的组织工程皮肤在灌注培养条件下有体外诱导形成毛囊的潜能。