环酰胺水解酶类是生物体内重要的水解酶之一，它们的作用底物尽管各不相同，但作用的化学键都是蛋白或多肽以外的各种有机环中酰胺键。它们大多属于金属依赖性的酶类，活性中心由数个结合二价金属离子的保守残基，即一个天冬氨酸和四个组氨酸残基组成。在空间结构上大多数属于(α/β)8桶结构。在生物体内这些酶常常参与嘧啶和嘌呤类的代谢，这些酶在工业上常用于氨基酸或有机酸的生物转化。根据底物专一性的不同将环酰胺水解酶分为环酰脲和环酰亚胺水解酶两大类型。前者包括了目前常见的海因酶、二氢嘧啶酶、尿囊素酶、二氢乳清酸酶。后者是一类文献报道较少，但在亚基分子量，氨基酸序列，底物谱均明显不同与前者的酶类。　　我们对本实验室保存的一株具有水解海因能力的菌株进行了鉴定，并对其中两种不同类型的环酰胺水解酶的基因进行了克隆，表达，纯化以及性质研究。　　1.菌株的鉴定　　对本实验室自行分离的能水解海因的菌株，进行了形态学观察，生化性质以及16S rDNA序列分析，结果表明该菌株的菌落形态呈杆状，极生单根鞭毛，革兰氏反应为阴性，氧化产酸。16S rDNA序列的比对分析进一步说明该菌株为恶臭假单胞杆菌，为此该菌定名为PseudomonasPutida YZ26。　　2.D-海因酶的基因克隆，表达，纯化与性质　　根据文献报道的D-海因酶的基因序列和氨基酸序列，设计PCR引物，以该菌基因组DNA为模板，经PCR扩增获得Pseudomonas putida YZ-26的D-海因酶基因。DNA序列分析表明，该基因全长1440bp，编码479aa，计算分子量为52kD，基因序列已在GenBank中登录(AY387829)，将推导的氨基酸序列进行BLAST比对，同Pseudomonas putida CCRC12857的同源性最高，为90.1％。D-海因酶基因分别克隆到不同的表达载体中(如pET3a，pET32M，pGEX-4T-1，pET28a)中，并在大肠杆菌BL21中表达，目的蛋白均获得可溶性表达。但表达量和酶的比活存在明显的差异，其中非融合表达(pET3a-HDT)的活力最高，依次为pET28a、pGEX-4T-1、pET32M。利用亲和及疏水层析两种不同的纯化路线，实现了重组酶的分离纯化。非融合蛋白的纯化经硫酸铵沉淀，疏水层析以及分子排阻层析，纯酶的比活为15.64U/mg，蛋白回收为43.2％;而融合蛋白经Ni2+-NTAagarose亲和柱和Sephacryl-S-200，纯酶的比活仅为4.05U/mg，蛋白回收为54.12％。对非融合D-海因酶的生化性质研究表明，该酶的单体分子量经飞行质谱，SDS-PAGE测定为52042 Da，而分子排阻层析显示，天然酶在溶液中为同源二聚体。酶的最适pH值为9.5，最适温度为45℃，Co2+和Mn2+对酶均有激活作用，但Zn2+、Cu2+、Ag+等引起酶活性的下降，进一步用分子排阻层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了Zn2+对该酶分子影响，结果表明锌离子可引起酶的同源二聚体解聚成单体。另外，构建了D-海因酶和N-氨甲酰酰胺水解酶基因串联的表达载体，并在大肠杆菌获得表达。初步结果表明，当以对羟基苯海因为底物时，重组串联酶的活性略低于两酶单个转化反应的活性。　　3.环酰亚胺水解酶的基因克隆，表达与性质　　Pseudomonas putida YZ-26基因组DNA，经EcoRI随机酶切构建亚克隆文库，在分离海因酶基因的过程中，我们发现并克隆到一个新的环酰胺酶，后确认为环酰亚胺酶(Cyclic imide hydrolase)。从阳性重组子的DNA序列分析表明，在2694bp的插入片段中有一个开放读框(ORF)为879 bp，将其推导的氨基酸序列在网上同源性比对分析，显示它和来源于Alcaligenes eatrophus112R4的环酰亚胺酶有78％的同源性，与Blastobacter sp.A17p-4环酰亚胺酶的N端20个氨基酸有80％的同源性。该基因序列已在GenBank登录(DQ093858)。　　将该开放读框进一步亚克隆到表达载体pET32M，最终构建N端融合6个组氨酸亲和臂的融合表达载体，重组酶在大肠杆菌中获得了高表达。利用Ni2+-NTA agarose亲和柱和Sephacryl-S-200最终获得电泳纯的环酰亚胺水解酶。比活为38.5 U/mg，活力回收为60.1％，纯化倍数为11.9。通过对其生化性质的研究表明，其单体分子量约为35 kDa，天然分子量为141kDa，在溶液中天然酶分子为同源四聚体。重组酶的最适pH为pH9.0，最适温度为50℃，金属离子对酶活性影响与同一菌株中D-海因酶基本一致。分别采用比色法和高效液相色谱法(HPLC)测定了环酰亚胺酶催化底物海因，二氢尿嘧啶，DL-5-苯海因、DL-ρ-对羟基苯海因及马来酰亚胺，琥珀酰亚胺的动力学参数，确认该酶对简单的环亚酰胺具有更高的活性及亲合力。　　进一步对环酰亚胺酶分子中组氨酸进行定点突变(H86A，H90A，H247A，H266A，H270A)和C末端的缺失和替换突变(CIH292(-K)、CIH291(-KK)、CIH290(-RKK)、CIH289(-PRKK)、KK292，293EE、KK292，293LL)，经酶活性测定，凝胶层析，荧光光谱，CD谱等分析，揭示该环酰亚胺酶的的组氨酸和酶的活性密切相关。C末端的赖氨酸残基在酶的活性，以及维持酶分子的空间构象上都具有至关重要的作用。