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【目的】探讨烟碱型乙酰胆碱受体α7(α7 n)及其特异性激动剂在脆性X综合征模型(Fmr1基因敲除小鼠)学习记忆中的作用及可能机制,为脆性X综合征的治疗提供新靶点。 【方法】 1、实验动物:4周龄FVB Fmr1基因敲除(KO)小鼠纯合子(-/-)及野生型(WT)纯合子(+/+)近交系小鼠。 2、利用 PCR法对4周龄 FVB Fmr1基因敲除( KO)小鼠和野生型(WT)小鼠进行基因型鉴定。 3、将实验小鼠分为:WT空白组和 KO空白组,用跳台实验分别检测 KO及 WT小鼠学习记忆的能力;再利用 RT-QPCR、Western Blotting、免疫组织化学分别检测KO及WT小鼠前额皮层及海马α7 nAChR的表达。 4、将 Fmr1基因敲除小鼠分为5组:生理盐水组,α7 nAChR特异性激动剂氯化胆碱(CC)治疗组6mg/kg组,60mg/kg组,100mg/kg组,150mg/kg组;将生理盐水及氯化胆碱连续腹腔注射10天,在第8和第9天腹腔注射完药物60分钟后用跳台实验检测各组的学习记忆能力;在第10天腹腔注射完药物60分钟后,用 Western Blotting分别检测各组小鼠前额皮层和海马α7 nAChR的表达。 5、数据的采集:跳台实验的数据通过所用的跳台仪自动显示出来;基因型PCR鉴定结果根据凝胶成像系统的图以及出现条带所对应的Marker大小判断;RT-QPCR的结果通过 RT-QPCR仪得出各组样品和内参的 CT值,再利用公式Ratio(test/calibrator)=ECT(calibrator)–CT(test)(假设反应每个循环模板量加倍,E为2)算出比值;免疫组织化学结果利用Image J图像分析软件统计出不同部位阳性细胞表达的个数;Western blotting结果用 Quantity One图像分析软件分析得出同一块胶内目的蛋白与内参的比值。 6、统计方法:采用 SPSS13.0统计软件进行分析,各组数据均用均数±标准差(-x±s)表示,两组间数据比较采用独立样本 t检验,多组间数据比较采用单因素方差分析,均数间两两比较采用 LSD-t检验,p<0.05为差异具有统计学意义。 【实验结果】 1、PCR基因鉴定结果:经 PCR,WT小鼠扩增出约为468bp的 DNA片断,KO小鼠扩增出约为800 bp的DNA片断,入组的KO小鼠均为Fmr1基因敲除小鼠纯合子(-/-),WT小鼠均为野生型纯合子(+/+)。 2、跳台实验结果:1)与 WT空白组比较,KO空白组第一天及第二天的潜伏期均显著缩短,错误次数明显增多,差异均具有统计学意义;2)与生理盐水组相比,各剂量氯化胆碱(CC)治疗组第一天的潜伏期均延长,但只有100mg/kg CC治疗组有统计学差异,各组间比较无统计学差异。3)各剂量CC治疗组第二天的潜伏期亦较生理盐水组延长,其中60mg/kg、100mg/kg CC治疗组差异具有显著性;60mg/kg、100mg/kg CC治疗组第二天的潜伏期较6mg/kg CC治疗组明显增加,差异有统计学意义;60mg/kg和100mg/kg CC治疗组的潜伏期均较150mg/kg CC治疗组显著延长,差异亦具有统计学意义,而60mg/kg CC治疗组与100mg/kg CC治疗组比较,无统计学差异。4)与生理盐水组比较,各剂量 CC治疗组第一天及第二天的错误次数均减少,其中60mg/kg CC治疗组、100mg/kg CC治疗组差异具有统计学意义;150mg/kg CC治疗组第一天及第二天的错误次数均6mg/kg、60mg/kg、100mg/kg CC治疗组明显增多,具有统计学意义,而100mg/kg CC治疗组第一天和第二天的错误次数均较6mg/kg CC治疗组显著减少,但只有第二天的错误次数具有统计学意义。 3、RT-QPCR结果:Fmr1基因敲除小鼠前额皮层α7 nAChR mRNA的表达量较野生型小鼠减少;Fmr1基因敲除小鼠海马区α7 nAChR mRNA的表达水平亦比野生型小鼠降低。 4、免疫组织化学结果:与野生型小鼠空白组相比,Fmr1 KO小鼠空白组前额皮层和海马区α7 nAChR免疫阳性细胞均显著减少(291.67±87.37 vs554.86±50.04,270±87.61 vs573.25±41.15),两者均具有统计学意义。 5、Western Blotting结果:1)与空白组WT小鼠相比,空白组KO小鼠前额皮层及海马区α7 nAChR表达量均减少,海马区更为显著,两者均具有统计学意义。2)与生理盐水组比较,不同剂量 CC治疗组前额皮层及海马区α7 nAChR表达水平均升高,且随剂量增加而升高,其中60mg/kg CC治疗组、100mg/kg CC治疗组及150mg/kg CC治疗组差异均具有统计学意义。3)与6mg/kg CC治疗组相比,60mg/kg CC治疗组、100mg/kg CC治疗组和150mg/kg CC治疗组前额皮层及海马区的α7nAChR表达量均增加,但只有100mg/kg CC治疗组和150mg/kg CC治疗组差异具有统计学意义。4)100mg/kg CC组的前额皮层及海马区α7 nAChR表达量较150mg/kg CC组下降,差异具有统计学差异。5)前额皮层及海马区α7 nAChR表达水平在60mg/kg CC治疗组、100mg/kg CC治疗组及150mg/kg CC治疗组间无统计学差异。 【结论】 1、Fmr1基因敲除小鼠与野生型小鼠比较,存在学习记忆障碍; 2、Fmr1基因敲除小鼠前额皮层、海马区的α7 nAChR表达量较野生型小鼠减少,提示α7 nAChR参与了Fmr1基因敲除小鼠学习记忆障碍的发病机制; 3、α7 nAChR特异性激动剂(氯化胆碱)通过上调 Fmr1基因敲除小鼠前额皮层、海马区的α7 nAChR的表达,从而改善其学习记忆能力。 4、氯化胆碱在 Fmr1基因敲除小鼠上的最佳有效剂量介于100mg/kg和150mg/kg之间; 5、α7 nAChR可能是治疗脆性X综合征的靶点之一。