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雄激素作为人体中一种重要的类固醇类激素,参与了许多发育和生理过程。雄激素的经典作用途径是通过与胞质中的雄激素受体(Androgen Receptor,AR)结合,形成激素-受体复合物后,被转运至胞核,与DNA上的反应元件相互作用,介导靶基因的转录调节,该途径作用缓慢,需要时间较长。此外,研究证实雄激素还可快速激活胞内的信号传导分子,通过非AR依赖途径发挥相关效应。该作用的特点是速度较快,通常在数秒至数分钟内完成,而且不依赖于AR介导的转录-翻译过程而直接产生相应效应。例如,雄激素可以快速使肾脏远端小管、免疫T细胞、人冠状动脉内皮细胞内Ca2+浓度增加等。这种现象被称为雄激素的非基因组效应。Ca2+作为普遍存在的第二信使之一,可广泛调节细胞内的效应,包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及基因表达等。研究已证实Ca2+参与了长时程增强(long-term potentiation , LTP )和长时程抑制(long-term depression,LTD)现象。LTP和LTD被认为是与学习记忆密切相关的神经突触可塑性的生物学基础。本课题将以小鼠海马神经元细胞系HT22细胞为细胞研究模型,通过分子生物学、形态学和电生理技术方法,探讨Ca2+/CaMKII是否介导雄激素非基因组效应对突触可塑性的影响。
目的:研究睾酮对海马神经元细胞系HT22细胞内Ca2+的影响及其机制;探讨Ca2+/CaMKII信号通路是否介导睾酮促进突触蛋白PSD95表达的雄激素非基因组效应。
方法:利用钙成像和共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+浓度;通过电生理技术测量HT22细胞膜电位;通过免疫蛋白印迹和免疫细胞荧光技术观察PSD95的表达量。
结果:
1.睾酮对海马神经元细胞系HT22细胞内Ca2+的影响及其机制的研究
(1)应用不同浓度的睾酮对海马神经元细胞系HT22细胞进行干预,钙成像实验结果发现睾酮对HT22细胞内Ca2+水平的影响存在时效性和量效性,100nM睾酮孵育20min时对细胞内Ca2+水平影响最高。因此在后续的实验中,我们选取100nM睾酮孵育20min为实验处理条件。
(2)通过使用是否含有Ca2+的两种不同的细胞外液,来探讨细胞内Ca2+增加的来源。钙成像和共聚焦实验结果显示细胞内增加的Ca2+来源于细胞外液中的外钙内流,而不是由于细胞内钙库的释放。
(3)利用膜片钳技术检测睾酮对HT22细胞膜静息电位的影响;通过给予L型钙通道阻断剂氨氯地平或N型钙通道阻断剂芋螺霉素孵育,观察结果显示L/N型电压门控性钙离子通道都参与了睾酮诱导海马神经元细胞系HT22细胞内Ca2+增加。
2.探讨Ca2+/CaMKII信号通路是否介导睾酮促进突触蛋白PSD95表达的雄激素非基因组效应。
(1)通过免疫蛋白印记和免疫荧光染色实验方法发现给于HT22细胞L型钙通道阻断剂氨氯地平或N型钙通道阻断剂芋螺霉素(预处理)后,显著抑制睾酮对PSD95蛋白水平的影响。
(2)通过免疫蛋白印记和免疫荧光染色实验方法发现给于HT22细胞CaMKII蛋白抑制剂KN-93刺激后,显著抑制了睾酮对磷酸化CaMKII蛋白的影响,而各组之前总CaMKII蛋白无明显差异。
(3)通过免疫蛋白印记和免疫荧光染色实验方法发现给于HT22细胞CaMKII蛋白抑制剂KN-93刺激后,显著抑制了睾酮对PSD95蛋白的影响。
结论:
1.100nM睾酮孵育20min时对细胞内Ca2+水平影响显著。
2.细胞内增加的Ca2+是膜上L/N电压门控通道介导的外钙内流。
3.睾酮通过提高外钙内流从而促进磷酸化CaMKII蛋白的表达。
4.睾酮可通过Ca2+/CaMKII途径促进PSD95蛋白的表达。
目的:研究睾酮对海马神经元细胞系HT22细胞内Ca2+的影响及其机制;探讨Ca2+/CaMKII信号通路是否介导睾酮促进突触蛋白PSD95表达的雄激素非基因组效应。
方法:利用钙成像和共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+浓度;通过电生理技术测量HT22细胞膜电位;通过免疫蛋白印迹和免疫细胞荧光技术观察PSD95的表达量。
结果:
1.睾酮对海马神经元细胞系HT22细胞内Ca2+的影响及其机制的研究
(1)应用不同浓度的睾酮对海马神经元细胞系HT22细胞进行干预,钙成像实验结果发现睾酮对HT22细胞内Ca2+水平的影响存在时效性和量效性,100nM睾酮孵育20min时对细胞内Ca2+水平影响最高。因此在后续的实验中,我们选取100nM睾酮孵育20min为实验处理条件。
(2)通过使用是否含有Ca2+的两种不同的细胞外液,来探讨细胞内Ca2+增加的来源。钙成像和共聚焦实验结果显示细胞内增加的Ca2+来源于细胞外液中的外钙内流,而不是由于细胞内钙库的释放。
(3)利用膜片钳技术检测睾酮对HT22细胞膜静息电位的影响;通过给予L型钙通道阻断剂氨氯地平或N型钙通道阻断剂芋螺霉素孵育,观察结果显示L/N型电压门控性钙离子通道都参与了睾酮诱导海马神经元细胞系HT22细胞内Ca2+增加。
2.探讨Ca2+/CaMKII信号通路是否介导睾酮促进突触蛋白PSD95表达的雄激素非基因组效应。
(1)通过免疫蛋白印记和免疫荧光染色实验方法发现给于HT22细胞L型钙通道阻断剂氨氯地平或N型钙通道阻断剂芋螺霉素(预处理)后,显著抑制睾酮对PSD95蛋白水平的影响。
(2)通过免疫蛋白印记和免疫荧光染色实验方法发现给于HT22细胞CaMKII蛋白抑制剂KN-93刺激后,显著抑制了睾酮对磷酸化CaMKII蛋白的影响,而各组之前总CaMKII蛋白无明显差异。
(3)通过免疫蛋白印记和免疫荧光染色实验方法发现给于HT22细胞CaMKII蛋白抑制剂KN-93刺激后,显著抑制了睾酮对PSD95蛋白的影响。
结论:
1.100nM睾酮孵育20min时对细胞内Ca2+水平影响显著。
2.细胞内增加的Ca2+是膜上L/N电压门控通道介导的外钙内流。
3.睾酮通过提高外钙内流从而促进磷酸化CaMKII蛋白的表达。
4.睾酮可通过Ca2+/CaMKII途径促进PSD95蛋白的表达。