第一部分:马兜铃酸-Ⅰ致胚胎干细胞衍生拟胚体分化肝样组织过程癌前病变评价模型建立目的:利用人类致癌剂马兜铃酸-Ⅰ(aristolochic acid I,AAI)与小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)细胞衍生拟胚体(embryoid body,EB)分化肝样组织过程共孵育体系,构建肝脏癌前病变体外替代研究模型,评价化合物是否具有潜在致肝癌前病变作用。方法:ES细胞经悬滴培养5天得EBs,EBs贴壁培养18天得成熟肝样组织;肝样组织分化成熟时(D5+18),免疫荧光考察肝样细胞及组织特异性蛋白表达;H&E染色考察肝样组织结构表型;qRT-PCR考察肝样细胞功能相关基因表达水平;ELISA法考察细胞培养上清液中白蛋白(albumin,ALB)分泌水平;糖原合成染色、吲哚氰绿(IndocyanineGreen,ICG)摄取、尿素合成实验考察肝样细胞功能。MTT法得AAI与EBs共孵育浓度;EBs贴壁培养当天(D 5+0)开始加入AAI;D 5+18时流式细胞术检测肝样细胞的分化率;ELISA法检测上清液中ALB、谷氨酸-丙酮酸转氨酶(alaninetransaminase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)的含量;免疫荧光检测ALB与IL-6、信号转导与转录激活子-3(signaling transducer and activator of transcription-3,STAT3)、磷酸化 STAT3(p-STAT3)、原癌蛋白 Myc(oncogenic transcription factor Myc,c-Myc)和癌胚RNA 结合蛋白 Lin28 同源物 B(oncofetal RNA-binding protein Lin28 homolog B,Lin28B)、AFP等共表达情况;Western Blot检测肝样组织中c-Myc、Lin28B、AFP及IL-6/STAT3、核转录因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)、丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)等信号通路蛋白表达情况;将成熟肝样组织注射到裸鼠背部皮下,考察肝样组织成瘤性;将肿瘤取出制备石蜡切片,H&E染色考察肿瘤的组成结构;免疫荧光考察ALB与AFP、胆管标志物细胞角蛋白7(cytokeratin7,K7)、细胞角蛋白 19(cytokeratin 19,K19)的共定位情况;Western Blot、qRT-PCR 法考察肿瘤组织恶性相关蛋白、基因的表达情况。结果:1.ES细胞衍生肝样组织鉴定:(1)形态学表征:D5+18时,光镜下肝样细胞呈成熟的双核表型;免疫荧光染色肝细胞特异性蛋白ALB、肝细胞核因子4α、α1-抗胰蛋白酶等呈阳性,ALB与肝血窦内皮细胞标志蛋白血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1镶嵌成肝样组织表型;H&E染色可见典型的肝样组织血窦样结构与肝样细胞镶嵌排列;(2)功能表征:qRT-PCR结果显示肝样细胞细胞色素P450代谢酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶等基因表达水平接近肝脏细胞实际水平;肝样细胞显示出稳定的ALB分泌水平、尿素合成水平、糖原合成水平及ICG摄取功能。2.AAI致ES细胞衍生EBs分化肝样组织过程癌前病变体外替代研究评价模型构建:(1)分化体系质控指标:终点流式细胞术、免疫荧光及ELISA结果显示,与DMSO相比,1.25μM及2.50μMAAI不影响肝样细胞的分化率、ALB分泌水平及肝血窦样结构;(2)ELISA结果显示,与DMSO相比,AAI显著上调肝样组织培养上清液中ALT、AST、IL-6及AFP的分泌量,提示肝样细胞膜受到损伤,肝样组织中Kupffer样细胞被激活,分泌大量IL-6,使肝样组织弥漫浸润在炎症微环境中;AAI显著上调肝样组织c-Myc及Lin28B的表达;加入AAI后,在终末分化的肝样组织中尚有表达幼稚的肝细胞合成分泌的AFP,极少量肝样细胞胞浆表达干性标志物八聚体结合转录因子-4(Oct4),提示AAI可能使肝样组织中部分肝样细胞发生了脱分化;(3)Western Blot结果显示,AAI可激活IL-6/STAT3通路、显著上调MAPK家族成员细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化水平及激活蛋白-1(activatorprotein 1,AP-1)成员c-Jun和c-Fos的入核水平;(4)体内评价阶段,DMSO与AAI组肝样组织细胞注射到裸鼠皮下均能成瘤;H&E染色结果显示,DMSO组肿瘤内细胞类型杂乱无章,呈畸胎瘤三胚层结构;AAI组肿瘤内部大多结构较单一,偶见畸胎瘤结构,部分肿瘤内存在细胞呈核大深染的HCC样特征区域;免疫荧光结果显示,DMSO组肿瘤未见ALB分别与AFP、K7、K19共染的细胞;AAI组肿瘤ALB与AFP、K7、K19的共染率分别为37.50%,54.17%和50.00%,提示AAI组肿瘤内的肝样细胞较幼稚,呈肿瘤祖/干细胞表型,这些细胞很可能是形成该组肿瘤的源细胞。结论:利用AAI引起ES细胞衍生EBs分化肝样组织炎性损伤伴癌前病变表型特征,初步构建了 ES细胞衍生EBs分化成熟肝样组织癌前病变体外预测评价体系,为研究肝脏癌前病变、预测评价化合物的潜在致肝脏癌前病变作用提供体外替代模型。第二部分:马兜铃酸-Ⅰ致分化成熟肝样组织癌前病变评价模型建立目的:利用AAI与ES细胞衍生成熟的肝样组织共孵育体系,构建肝脏癌前病变体外替代模型,评价化合物是否具有潜在致肝癌前病变作用。方法:ES细胞经悬滴培养5天EBs,EBs贴壁培养18天得成熟肝样组织;MTT法得AAI与成熟肝样组织共孵育浓度;肝样组织分化成熟时(D 5+18)开始持续加入AAI 10天(D 23+0至D 23+10);D 23+10时,ELISA法检测细胞培养上清液中ALB、IL-6含量;免疫荧光检测ALB与p-STAT3、c-Myc、Lin28B、AFP、NF-κB(p65)及 NF-κB(p50)共定位情况。结果:1.25,2.50,5.00,10.00 μMAAI与成熟肝样组织共孵育10天,ELISA和免疫荧光结果显示,与对照组相比,1.25,2.50 μM AAI不影响肝样细胞表达并分泌ALB水平,5.00,10.00 μM AAI分别从加入第8天和第6天起显著下调ALB分泌水平;其中与10.00 μM AAI共孵育还伴有少量肝样细胞凋亡发生;1.25,2.50,5.00,10.00 μM AAI均能显著上调IL-6分泌水平;与10.00 μMAAI共孵育时,IL-6分泌呈先升后降的趋势;综合考虑选择5.00 μM AAI进行后续实验;免疫荧光结果显示,与5.00μM AAI共孵育10天,肝样组织中出现少量c-Myc,Lin28B,AFP与ALB共表达的肝样细胞,同时NF-κB(p65)也有少量入核激活,提示AAI与分化成熟的肝样组织共孵育也可引发癌前病变。结论:初步构建了分化成熟的肝样组织与AAI共孵育癌前病变体外预测评价体系,为研究肝脏癌前病变、预测评价化合物的潜在致肝脏癌前病变作用提供体外替代模型。附:积雪草酸、五味子乙素对马兜铃酸-Ⅰ致胚胎干细胞衍生EBs分化肝样组织炎症及癌前病变对抗活性相关研究目的:探索积雪草酸(Asiatic acid,AA)和五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是否具有对抗AAI致ES细胞衍生EBs分化肝样组织炎症损伤和癌前病变的活性,论证该体外替代模型的适用性。方法:MTT法得AA和Sch B分别与AAI共孵育ES细胞及EBs分化肝样组织过程共孵育的浓度;EBs贴壁培养当天开始加入2.5 μM AAI和适合浓度的AA或SchB,肝样组织分化成熟时,流式细胞术检测肝样细胞分化率;ELISA法检测培养上清液中ALB、ALT、IL-6和AFP含量;免疫荧光检测ALB与IL-6、c-Myc和Lin28B等蛋白共定位情况;Western Blot法检测肝样组织中炎症、癌前病变相关蛋白的表达;分别将与DMSO、AAI、AAI+AA共孵育的肝样组织注射到裸鼠皮下,考察AA对AAI致衍生肝样组织成瘤性的影响;将肿瘤取出制备石蜡切片,H&E染色考察各组肿瘤的组成结构,免疫荧光双染法考察癌前病变相关蛋白的表达情况。结果:(1)ELISA结果显示,单加AAI组上清液ALT、IL-6和AFP较DMSO组均显著上调;1.00 μM AA及5.0、10.0 μM Sch B与AAI共孵育,上清液ALT和IL-6含量显著下调;仅1.00 μMAA与AAI共孵育,AFP的含量与单加AAI组相比显著下调,而SchB不能下调上清液中AFP的含量。(2)Western Blot及免疫荧光结果显示,1.00 μM AA显著下调AAI致c-Myc、Lin28B、AFP的表达上调,Sch B不能下调AAI引起的c-Myc、Lin28B和AFP的表达上调;AA、Sch B可显著下调AAI致衍生肝样组织IL-6/STAT3、p-ERK1/2 MAPK及c-Fos AP-1的表达上调,且10.0 μM SchB可显著上调Nrf2的表达。(3)体内评价阶段H&E染色显示,AAI+AA组呈细胞核大深染、有丝分裂相多、排列紊乱、假小叶或微血管浸润等HCC样表型的肿瘤数量(10/23)与AAI组(11/23)没有显著性差异;免疫荧光结果显示,与DMSO组相比,AAI组肿瘤ALB与AFP、K7、K19共染的细胞显著增多,共染率分别为43.48%,69.57%和65.22%;AAI+AA组ALB+AFP共染率显著下调至17.39%,而ALB与K7、K19的共染率与AAI组相比没有显著改变。结论:AA对AAI致ES细胞衍生EBs分化肝样组织过程炎性损伤及癌前病变表型,具有一定体外对抗活性;SchB对AAI致ES细胞衍生EBs分化肝样组织过程炎性损伤,具有一定体外保护活性,但对癌前病变相关表征未呈现干预活性。