人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一类能引起皮肤和黏膜鳞状上皮增殖的DNA肿瘤病毒。高危型HPV的感染与宫颈癌、食管癌、喉癌、鼻咽癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。HPV主要编码八种蛋白,其中E6、E7、E5为癌蛋白,它们可以通过与细胞中多种癌基因、抑癌基因及细胞受体相互作用,诱导细胞的恶性增殖及转化。目前,对于HPV致癌机制的研究主要集中在E6、E7两种癌蛋白上,而对于E5蛋白功能及致癌机制的研究却很少,并且主要集中在HPV16型E5蛋白。已知HPV18属于另一种常见的高危型HPV病毒,然而关于HPV18 E5蛋白在肿瘤形成过程中的作用及其机制仍不明了,因此有必要针对HPV18型E5蛋白诱导的细胞恶性转化及其调控机制开展相关研究。如果明确了HPV18 E5蛋白对细胞的恶性转化作用及其参与的细胞调控机制,就可以针对性地设计相应的疫苗和靶向药物。本文从系统进化的角度分析E5蛋白的系统发育与致癌性之间的关系。结果表明,同一“属”的同一“种”乳头瘤病毒E5蛋白在系统发育树上属于同一个分支,并且E5蛋白的系统发育与致癌性之间具有相关性,即高危型HPV的E5蛋白之间具有相近的系统发育关系,低危型HPV的E5蛋白之间具有相近的系统发育关系。通过对唐山地区食管癌样本中HPV18 E5、E6、E7、L1基因的检测分析发现,有34/94(36%)的样本中存在HPV18 E5基因序列,28/94(30%)的食管癌样本中可以同时检测到HPV18 E5、E6、L1基因的存在,25/94(27%)的样本中可以同时检测到HPV18 E5、E6、E7基因的存在。在HPV18 E5阳性的食管癌样本中,有4例样本发生了E5基因序列的突变,其中3例样本的突变发生在起始密码子位置。构建pSecTag-HPV18E5真核表达重组质粒,将其转染Balb/c 3T3细胞,利用质粒上的博来霉素抗性基因,筛选获得能稳定表达HPV18 E5蛋白的阳性细胞株,通过CCK-8法、流式细胞术,分析HPV18 E5对细胞增殖及周期的影响。结果表明,HPV18 E5阳性细胞的增殖加快,S期和G2/M期在细胞周期中的比值增加,而G1期的比值下降。构建并以能表达HPV18 E5蛋白的腺病毒为载体,运用本实验室已建立的二阶段细胞转化实验平台,分析HPV18 E5蛋白诱导Balb/c 3T3细胞恶性转化的能力。应用软琼脂克隆实验检测转化细胞在软琼脂上形成克隆的能力。并通过细胞划痕实验和Transwell实验检测转化细胞的迁移和侵袭能力。使用SCID小鼠致瘤实验检测HPV18 E5转化细胞在小鼠体内形成肿瘤的能力。结果表明,与正常Balb/c 3T3细胞相比,感染了HPV18 E5腺病毒的Balb/c 3T3细胞,其细胞形态及功能发生了明显的变化,表现在细胞呈致密多层生长、嗜碱深染、失去细胞间的接触抑制及细胞的锚定生长作用。HPV18 E5转化细胞形成20.00±0.58个转化灶,将转化灶细胞接种在软琼脂上,克隆形成率为26.2±0.63%,而正常细胞却不能在软琼脂上生长。转化细胞具有迁移和侵袭的能力,并能够在SCID小鼠体内形成成纤维瘤(1.5±0.3 cm)。结果说明,HPV18 E5蛋白具有诱导Balb/c 3T3细胞恶性转化的能力。通过real-time PCR实验以及western blot实验检测转化细胞中p21、p27、EGFR基因在转录和蛋白表达水平上的变化。结果表明,HPV18 E5转化细胞中p21、p27基因的mRNA和蛋白表达水平均下调,EGFR基因的mRNA及蛋白表达水平均有升高。实验结果说明,HPV18 E5蛋白可能是通过激活EGFR信号通路影响p21、p27等下游通路中抑癌基因的表达,从而诱导细胞的恶性增殖及转化。综上所述,本研究证实了HPV18 E5蛋白具有诱导细胞恶性转化的能力,其机制可能是通过激活EGFR信号通路,影响细胞中p21、p27抑癌基因的表达,使得细胞发生恶性转化。本研究对于阐明HPV18的致癌机理具有重要意义,并为HPV疫苗的研发提供了新的思路。