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癫痫是一种常见的以脑部神经元突然过度放电所致的反复和短暂的中枢神经系统功能失常为特征的慢性临床综合症。其发病机制一直是研究的焦点,如离子通道、神经递质、突触的可塑性、胶质细胞与癫痫发病机制等,其中神经元可塑性与癫痫发病机制关系的研究备受关注,成为多年来研究的热点,并取得了重要进展。研究表明,癫痫发作后神经元发生了可塑性变化,其包括:1结构的可塑性,表现为突触结构的修饰即某些结构参数的改变(如突触后结构的密度、突触界面曲率或弯曲度、突触穿孔等)、新突触形成(突触密度增大或数量增多)和突触重排等;2功能的可塑性,即突触传递的可塑性,表现为突触传递效率的增加(易化)或降低(抑制),长时程增强(long term potentiation,LTP)。业已发现癫痫患者和癫痫动物模型一样,在癫痫发作后患者大脑内神经元发生了可塑性变化:神经元之间形成异常的突触联系,建立起病理性神经环路,导致大脑兴奋性增强。有学者认为即刻早期基因(IEG)在上述神经元可塑性变化中起了关键作用,在癫痫灶形成过程中,IEG(c-fox.、C-jun.、krox基因)及其编码的基因启动蛋白(AP)充当第三信使,AP诱导的靶基因称为迟反应基因(LRG),其表达产物有神经递质、神经营养因子、神经调节因子、受体和突触结合蛋白等,LRG的表达产物使神经网络的兴奋性和神经元固有成分改变如γ-氨基丁酸(GABA)释放减少和(或)GABA受体敏感性降低、谷氨酸(Glu)释放增加和(或)Glu受体敏感性增强、突触囊泡蛋白形成并改变神经递质释放过程以及神经出芽和新突触形成。但这些研究均在癫痫发作后进行的。为了避免癫痫发作对研究结果的干扰,便于直接观察癫痫形成过程中的病理变化特征,本研究采用了癫痫形成过程中即癫痫发作前的动物模型作为研究对象来进行研究。寻找合适的动物模型是研究的关键,点燃是一种癫痫形成现象,戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)是一种诱导癫痫的急性和慢性点燃模型以研究癫痫的发病机制的中枢神经系统兴奋药,PTZ点燃大鼠已被广泛用作研究癫痫的理想动物模型。我们前期研究工作发现:应用电镜、Timm染色等从形态结构方面已证实在点燃前神经元发生了可塑性改变包括苔藓纤维芽生,新突触形成(突触密度增大或数量增多)与突触重排等,但这些只是一个初步探索,仍不能够说明问题的全部,如其分子生物学基础、神经元凋亡情况等尚不清楚,需进一步研究探讨。神经细胞凋亡是神经细胞死亡的一种形式,也是异常兴奋性突触环路形成的重要原因。许多资料显示癫痫发作后,神经细胞凋亡数明显增加,凋亡相关基因P53、bax的表达都明显增加,尤其P53表达的增加可引起神经细胞广泛性死亡,导致神经元间突触联系重组的神经可塑性变化。核因子Kappa B(NF-KB)是一种重要的核转录因子,参与真核细胞多种基因的表达调控,影响着细胞的许多生物学功能。研究表明NF-KB与突触可塑性的信号转导有关,参与神经元可塑性的形成。生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)在脊椎动物非神经组织很少表达,所以被认为是神经系统特异性蛋白。在突触前膜含量极高,胞浆含量极低,研究已证实有两种类型突触可塑性变化与GAP-43的表达相关,(1)突触形态结构变化可导致GAP-43表达的升高,(2)由突触长时程增强和突触长时程抑制所引发的突触效能的变化,可影响GAP-43的磷酸化状态和其mRNA的表达。突触素(synaptophysin,P38)系一相对分子质量为38000的膜结构蛋白,存在于突触前囊泡膜,与突触的结构和功能密切相关。P38作为突触前终末特异性标记物,常用来反映突触的密度和分布。测定P38的含量变化是监测神经系统突触形成及其功能状态的方法之一。由于胶质细胞不表达P38,因此反映神经元的可塑性。神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)是细胞表面的一种糖蛋白,属免疫球蛋白超家族,是细胞粘附分子中的一员,主要表达于神经系统,位于轴突膜和突触前、后膜上,在正常神经元轴突的生长、突触的可塑性、神经纤维的成束等过程中起重要作用。研究表明NCAM作为粘附分子中的一员,其在癫痫发作后有明显变化.PTZ点燃前即亚剂量PTZ慢性刺激癫痫发作之前神经元凋亡数、NCAN、NF-KB、GAP-43和P38表达有无改变以及NF-KB活化机制尚未见报道。本研究检测了癫痫发作前即癫痫形成过程中细胞凋亡的变化和NF-KB、NCAM、GAP-43及P38的表达变化以及NF-KB活化机制,以进一步论证癫痫发作前即发生可塑性变化及其分子基础来探讨癫痫的发病机制。研究目的:1、探讨细胞凋亡在癫痫形成过程中的作用:通过对点燃前苯巴比妥干预组、非干预组和对照组大鼠海马神经元凋亡的检测,论证细胞凋亡在癫痫形成过程中的作用;2、探讨神经元可塑性在癫痫形成过程中的作用:通过检测点燃前大鼠海马神经可塑性标志物GAP-43、NF-κB和P38表达的变化,探讨NF-KB、GAP-43和P38在癫痫形成过程中的作用,阐明癫痫形成过程中是否发生了神经元可塑性变化;3、探讨癫痫发生前NCAM的作用:通过检测点燃前大鼠海马NCAM表达的变化,阐明NCAM在癫痫形成过程中的作用。4、研究钙离子与NF-KB间的调控关系:通过观察PTZ对NF-κB及Ca2+的影响,论证钙离子与NF-KB间是否存在调控关系,阐明NF-κB如何在癫痫可塑性改变中起作用。研究方法:1、以PTZ(40mg/kg,腹腔注射,每日一次)点燃Wistar大鼠为对象,取点燃前大鼠海马为标本,运用末端转移酶标记技术(Terminal deoxynucleotidyl TransferaseBiotin-dUTP Nick End Labeling,TUNEL)、流式细胞仪测定对照组、苯巴比妥干预组和非干预组点燃前大鼠海马细胞凋亡情况;2、以PTZ点燃Wistar大鼠为对象,取点燃前大鼠海马为标本,运用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、Western Blot检测技术测定对照组、苯巴比妥干预组和非干预组点燃前大鼠NF-κBmRNA、GAP-43及P38蛋白表达;3、以戊四氮(penlylenetrazol,40mg/kg,腹腔注射,每日一次)点燃Wistar大鼠为对象,取在点燃前不同时间点的大鼠海马为标本,运用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术测定对照组,、苯巴比妥干预组和非干预组在点燃前各时间点大鼠海马NCAM mRNA表达。4、将传代培养的神经元样PC12细胞随机分为PTZ干预组(PTZ组)和不经戊四氮干预的对照组,运用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)检测不同处理条件下神经元样PC12细胞内Ca2’浓度变化与NF-KB核移位的情况。研究结果:1、点燃前苯巴比妥干预组和非干预组海马细胞凋亡数和对照组无明显变化(P>0.05),差异无显著性意义(P>0.05);2、非干预组海马NF-κB mRNA、GAP-43及P38蛋白表达均明显高于对照组(P<0.01),苯巴比妥干预组NF-κ,B、GAP-43及P38表达量低于非干预组(P<0.05),差异有显著性意义,;3、非药物干预组大鼠均于17-23天点燃,而药物干预组在30-38天点燃,苯巴比妥药物干预组NCAM mRNA表达明显低于非干预组相应时间点NCAM mRNA表达,有明显差异(P<0.01).非干预组NCAM mRNA表达明显高于对照组,有显著性差异(P<0.01)。4、PTZ组NF-κB在核表达明显比对照组增多,NF-κB核移位提示神经元样细胞活化;PTZ组细胞内Ca2+浓度明显比对照组增高。研究结论:1、点燃前苯巴比妥干预组和非干预组海马细胞凋亡数和对照组无明显变化,证明癫痫形成过程中海马神经元未发现明显凋亡现象;2、点燃前神经可塑性标志物GAP-43和P38发生了变化,证明神经元可塑性在癫痫发作前即发生变化。点燃前海马NF-κB mRNA蛋白均明显高表达,苯巴比妥能抑制NF-κB的表达,表现和神经可塑性标志物GAP-43和P38一样的变化,证明NF-κB也参与了癫痫发作前可塑性变化,是这种可塑性变化分子基础;3、点燃前NCAM mRNA表达量与点燃过程呈正相关;说明NCAM在癫痫发作前可塑性变化中起了作用4、PTZ能够激活NF-κB,同时也能使细胞内Ca2+浓度升高,说明NF-KB的激活可能存在着Ca2+调控通路,神经元可塑性变化机制中可能存在着与“Ca2+调控”相关的NF-κB激活途径。