高粱单宁结构比较复杂,定量分析相对困难。目前国际标准中高粱单宁的测定采用柠檬酸铁铵法,国内标准同样采用该方法,但该方法特异性较差,方法中的标准品为单宁酸(TA),其与高粱中的单宁在结构以及反应性质上都存在显著差异,作为标准品将造成不准确的定量。本课题首先对高粱单宁进行提取并采用葡聚糖凝胶LH-20(Sephadex LH-20)层析法进行了分离纯化,根据单宁聚合度的不同使用正相高压液相(NP-HPLC)二醇柱分离后对单宁的纯度进行计算,得到了纯度较高的单宁(ST)为后续探索分光光度法中定量高粱单宁的市售标准品TA,表儿茶素(EA)以及原花青素(PA)提供参考。接着对柠檬酸铁铵法和香草醛法定量单宁含量的实验步骤以及标准品进行了改进研究,然后探索了普鲁士蓝法,酸正丁醇法以及蛋白质沉淀法定量高粱单宁的实验步骤以及标准品,最后对五种分光光度法进行了优缺点的比较分析。本研究的实验目的是根据ISO 9648-1988“Sorghum-Determination of tannin content”国际标准草案的修订工作要求,选择特异性好,灵敏度高,简单快捷,可以普遍应用于国际各实验室间定量高粱中单宁含量的分光光度法。(1)高粱单宁的提取分离与纯度鉴定。结果表明:采用95%乙醇提取高粱单宁并采用Sephadex LH-20进行分离纯化,流动相无水乙醇洗脱的主要物质为非单宁酚类与部分单宁,丙酮:水(1:1)溶液洗脱组分中的主要物质为ST。通过色谱分析得到纯度为98.62%的高粱单宁,为后续方法中标准品的选择提供参考。(2)柠檬酸铁铵法定量高粱单宁的分光光度法改进研究。结果表明:方法中PA作为标准品优于TA和EA,其结构和颜色生成量更接近ST,相比于TA可以提高方法的准确性。作为替代提取溶剂的70%丙酮水溶液具有仅次于75%二甲基甲酰胺(DMF)水溶液的提取效果,毒性较低,提高了方法的安全性。提取条件优化为料液比:0.5:20(V/V),提取时间30 min,提取温度为20℃,较原方法不仅可以节省物料,缩短提取时间,更适用于大批量样品检测。验证了该方法的回收率和重复率均可达到AOCO规定的范围。(3)香草醛法定量高粱单宁的分光光度法改进研究。结果表明:方法中标准品PA的反应动力学比EA更接近ST,提取条件优化为料液比:0.5:20(V/V),提取时间30 min,提取温度为20℃,反应条件优化为:2.5 m L质量分数为1%香草醛甲醇溶液与2.5m L体积分数为15%的硫酸甲醇溶液,提高了方法的灵敏度,验证了该方法的回收率和重复率均可达到AOCO规定的范围。(4)探索了普鲁士蓝法,酸正丁醇法以及蛋白质沉淀法定量高粱单宁的方法步骤,标准品PA同样适用于普鲁士蓝法,酸正丁醇法以及蛋白质沉淀法。五种方法比较分析结果表明:柠檬酸铁铵法与普鲁士蓝法相似,是定量高粱总酚类的方法,并不能区分单宁与非单宁酚类物质,特异性较差;香草醛法对黄烷醇类物质具有特异性,并非总酚类物质,灵敏度高,操作简单;酸正丁醇法对单宁的特异性强,但可能出现酸解不彻底,稳定性差,存在副反应等缺点;蛋白质沉淀法特异性较强,但沉淀能力较差,存在低估的可能,方法的稳定性与重复性差。相比于ISO 9648-1988“Sorghum-Determination of tannin content”方法,香草醛法具有较好的特异性且采用PA作为标准品提高了方法的准确性。综上所述,选择香草醛法作为ISO 9648标准:高粱中单宁含量测定方法。