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目的:探究苦参素(matrine,MAT)对多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)的经典动物模型—实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠的神经功能学指征和脑组织病理学特征的影响,通过观察其中星形胶质细胞表面标志物—胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPG)的含量变化探究MAT对EAE大鼠脑中星形胶质细胞增殖情况的影响。同时,检测分析其中鞘氨醇(sphingosin,SPH),磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)和血浆凝溶胶蛋白(plasma gelsolin,pGSN)的含量变化,鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SPHK)的表达变化以及星形胶质细胞表面磷酸鞘氨醇1型受体(sphingosine 1-phosphate receptor 1,S1P1)表达的变化情况,探究MAT抑制EAE大鼠脑中星形胶质细胞增生现象的作用机制,为临床探索治疗MS的方法提供实验和理论依据。方法:1.建立EAE大鼠模型:在冰浴和无菌条件下制备豚鼠全脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate,GPSCH),与等体积含卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)6mg/ml的完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)均匀混合,制成稳定的油包水(W/O)型抗原乳剂,四肢足垫皮下注射6~8周龄的雌性Wistar大鼠(0.5ml/只),建立GPSCH诱导的EAE大鼠模型。自免疫当天起,由两名实验人员每日独立进行实验动物神经功能学评分。2.动物分组及给药:采用随机数字表法,将30只免疫后大鼠分为三组:EAE模型组(EAE+Saline)-自免疫后第1天起每日腹腔注射生理盐水(6.7ml/kg);苦参素治疗组(EAE+MAT)-自免疫后第11天起每日注射用生理盐水稀释后的苦参素注射液6.7 ml/kg(250mg/kg)和苦参素预防组EAE+MAT-P(MATPretreatment)-自免疫后第1天起实施与苦参素治疗组等量的治疗措施。三组实验动物均干预至免疫后第17天。3.动物标本采集:免疫后第18天,将动物麻醉后,用生理盐水心脏灌注后留取大鼠脑组织并用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)冲洗。之后将右脑立即投入液氮中保存,左脑用4%多聚甲醛固定保存。4.相关指标检测:苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)和劳克坚牢蓝((Luxol fast blue,LFB)染色分别观察动物脑组织中炎性浸润和脱髓鞘的情况,免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)检测GFAP、CSPG的表达以及GFAP与S1P1的共表达,蛋白质印记法(western blot,WB)检测GFAP、pGSN的表达,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定SPH和S1P浓度,定量实时聚合酶链反应技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测SPHK1和SPHK2的mRNA表达。使用GraphPad Prism6.0软件对实验数据进行统计学分析。结果:1.神经功能学评分:统计分析结果显示,在EAE大鼠的发病高峰期(免疫后第18日),苦参素治疗组大鼠的神经功能学评分低于EAE模型组(P<0.001),且预防组与治疗组大鼠的神经功能学评分也存在显著差异(P<0.05)。2.脑组织病理学变化:与EAE模型组相较,苦参素对照组大鼠脑内炎性细胞浸润和脱髓鞘的情况明显缓解(P<0.001,P<0.01),苦参素预防组的情况又较于对照组发生明显缓解(P<0.05,P<0.01)。3.脑组织中星形胶质细胞增生情况的变化:western blot与免疫荧光染色结果显示,与苦参素治疗组相较,EAE模型组大鼠脑内的GFAP蛋白的表达量和荧光强度都明显更高(P<0.001,P<0.01),而苦参素预防组则较治疗组表达更低(P<0.001,P<0.01);与EAE模型组相较,苦参素治疗组大鼠脑内的CSPG的荧光强度亦表达显著降低(P<0.01),而苦参素预防组则表现出更低的趋势(P<0.05)。4.脑组织中S1P,SPH,pGSN的蛋白表达及SPHK1和SPHK2 mRNA的表达变化:ELISA结果显示,与EAE模型组相比,苦参素治疗组大鼠脑内S1P和SPH的含量均显著降低(P<0.001,P<0.001),苦参素预防组亦较治疗组显著降低(P<0.001,P<0.001);qRT-PCR结果表明,经苦参素治疗后,EAE模型组大鼠脑内SPHK1和SPHK2 mRNA的表达均明显减少(P<0.05,P<0.001);与苦参素治疗组相比,苦参素预防组大鼠脑内SPHK1 mRNA的表达量发生显著降低(P<0.001),而两组的SPHK2 mRNA表达量则无显著差异。此外,用western blot检测脑组织内pGSN表达,结果显示与EAE模型组相比,苦参素治疗明显提升了大鼠脑内pGSN蛋白的表达量(P<0.001),而苦参素预防组的pGSN蛋白量亦明显低于苦参素治疗组(P<0.001)。5.脑内及星形胶质细胞上的S1P1的表达量:qRT-PCR结果显示,与EAE模型组比较,苦参素治疗组大鼠脑内S1P1 mRNA的表达量显著降低(P<0.001),而苦参素预防组与之未表现出显著差异;与此对应,免疫荧光双染结果表明,与苦参素治疗组比较,EAE模型组大鼠脑内的星形胶质细胞表达更多的S1P1受体(P<0.001),而苦参素预防组未表现出与模型组的统计学差异。结论:MAT对EAE大鼠有良好的治疗及预防效果,可以显著抑制EAE大鼠脑内的星形胶质细胞增生。MAT可以显著降低EAE大鼠脑内的S1P含量,是通过抑制SPH的产生和SPHK1&2的表达,上调pGSN,并且抑制S1P1在星形胶质细胞上的表达,从而起到对EAE大鼠病情的治疗及预防作用。