【摘 要】
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哺乳动物的大脑由数量繁多且高度异质的神经元组成,这些神经元相互交织和联系,形成了处理信息和指导行为的复杂神经回路。识别神经元的细胞类型,对研究神经回路至关重要。基于分子标记物来标记神经元类型,是对特定神经元群体进行可靠的实验研究的首选策略。其中,依赖Cre品系小鼠靶向特定类型神经元的遗传策略是一种被普遍使用的标记方法。但Cre品系小鼠的种类有限,使得这类遗传策略的发展和应用受到限制。本文发展了一种
【基金项目】
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华中科技大学校人才引进基金项目的资助（No.3004187125）；
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哺乳动物的大脑由数量繁多且高度异质的神经元组成,这些神经元相互交织和联系,形成了处理信息和指导行为的复杂神经回路。识别神经元的细胞类型,对研究神经回路至关重要。基于分子标记物来标记神经元类型,是对特定神经元群体进行可靠的实验研究的首选策略。其中,依赖Cre品系小鼠靶向特定类型神经元的遗传策略是一种被普遍使用的标记方法。但Cre品系小鼠的种类有限,使得这类遗传策略的发展和应用受到限制。本文发展了一种将CRISPR-Cas9系统和模块化的二元表达系统相结合的病毒策略,该策略仅需更换AAV-g RNA（targeted gene）-driver病毒,就能像Cre品系小鼠一样靶向不同基因型的神经元,从而丰富研究者的工具选择范围。该策略共需注射三种混合病毒:AAV-g RNA（targeted gene）-driver、AAV-Sp Cas9和AAV-reporter,其利用CRISPR-Cas9介导的同源无关的靶向整合（homology-independent targeted integration,HITI）,将二元表达系统中的“driver”基因整合到内源基因（targeted gene）的特定位点,从而实现“driver”基因的细胞特异性表达。本文的研究结果如下:（1）本文选取了小鼠大脑中4个表达丰度不同的基因,其中3个基因（CaMKIIα、Pthlh、Rxfp1）基于tTA/TRE二元系统设计为AAV-g RNA（targeted gene）-tTA病毒,第四个基因Gad1基于Dre/rox二元系统设计为AAV-g RNA（targeted gene）-Dre病毒;并分别在表达相应基因的脑区注射三种混合病毒。结果显示,针对该病毒策略的两种二元系统设计的不同的AAV-g RNA（targeted gene）-driver病毒,均能标记上对应脑区的神经元及其远端投射,并且标记的投射区域与文献报道的结果吻合。以上结果初步证明了本研究设计的病毒策略具有可实施性。（2）为了提高神经元类型靶向的精度,本文进一步将二元表达病毒策略与Cre品系小鼠相结合,扩展了一种靶向双基因定义的细胞类型的交叉策略。基于tTA/TRE的交叉策略需注射三种混合病毒:AAV-g RNA（targeted gene）-tTA、AAV-Sp Cas9和AAV-TRE-DIO-reporter;而基于Dre/rox的交叉策略需注射三种混合病毒:AAV-g RNA（targeted gene）-Dre、AAV-DIO-Sp Cas9和AAV-d DIO-reporter。使用这种交叉策略,本文标记了纹状体的CaMKIIα/Drd1神经元,初级运动皮层的CaMKIIα/Drd1神经元、CaMKIIα/Sst神经元和Gad1/Drd1神经元。其中基于tTA/TRE的交叉策略标记的CaMKIIα/Drd1神经元和CaMKIIα/Sst神经元的投射符合特定脑区神经元或Drd1神经元类型或Sst神经元类型的投射分布。另一种基于Dre/rox的交叉策略标记的神经元亮度低,且无明显轴突。以上标记双基因定义的神经元类型的结果,也说明了本研究设计的病毒策略具有可扩展性,能减少双转基因小鼠或多转基因小鼠的使用。（3）本文验证了tTA/TRE系统标记的CaMKIIα神经元中,插入序列能正确整合到CaMKIIα位点,并验证了标记的神经元部分属于CaMKIIα神经元;以及验证了Dre/rox系统标记的Gad1神经元具有83.5%的准确性,进而说明该病毒策略具有可推广使用的潜力。
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