本论文目的是进行蛋白质分子的固定和检测，论文中涉及的与蛋白相关的平台有两种：硅橡胶和晶体硅。论文分两部分讨论。 第一部分：硅橡胶硅橡胶全名聚二甲基硅氧烷，主要含有两个部分：聚氢基硅氧烷和聚烯基硅氧烷。前者是直线型高分子材料，分子量处于几万到几十万之间，也称聚合物：后者分子量略小，也称为交联剂。它们在催化剂作用下发生硅氢化反应，生成三维网状结构胶体材料。通常，将氧化硅作为填料置于其中，其目的是调节硅橡胶的机械模量。硅橡胶非常稳定，它耐酸、耐碱、抗氧化性好、绝缘性高、生物兼容性好，在汽车、药物释放、医疗器械、电子、食品卫生、制模等方面有极大的应用前景。其中，在制模方面，良好的图案复制性能使硅橡胶在微流控芯片和微接触印刷等微纳米技术方面具有其它材料无可比拟的优越性。普通的微流控芯片由两层组成：这里称为“控制层”和“流体层”。控制层中富含聚氢基硅氧烷基团，而流体层富含聚烯基硅氧烷。在流体层中软刻有微米级管道，两部分紧贴在一起加热键合，就组成一个密闭的管道电泳系统。微流控芯片主要用来分离蛋白、肽、DNA分子等。但是，对于通常的富含聚烯基硅氧烷流体层，其机械性能很差(我们测的杨氏模量仅仅0.15 MPa)，这样的模量一般不能够满足做流体渠道以及阀门等的需要，但是，一旦与控制层键合之后，它的机械性似乎变强，作渠道、阀门等也没问题了。我们认为有某种成分从控制层中扩散到流体层中了，我们的工作也就是从这里开展起来的，具体操作是这样的： (1)我们设计了实验证明了聚氢基硅氧烷基团从控制层中扩散到流体层中。实验分为两步：第一步先用全反射衰减红外证明在流体层中出现了聚氢基硅氧烷。我们用1：3和1：4分别作为控制层，用1：20和1：30分别作为流体层。两部分键合之后，全反射衰减红外测试流体层底部的成分，结果，富含聚烯基硅氧烷的流体层出现了聚氢基硅氧烷的特征峰；第二步，我们推测：扩散过来的聚氢基硅氧烷应该能同聚烯基硅氧烷发生硅氢化反应，那么，流体层中硅橡胶的交联度就会提高，其机械性能就改善了。但我们要测试杨氏模量的流体层已经同控制层键合一起，不可能分开了。为此，我们设计了一个牺牲层(大约10微米)嗔充在控制层和流体层中间，这样流体层就容易从上面揭下来了。然后测试扩散前后的流体层的机械性能。结果，扩散后，流体层的杨氏模量从0.15增加到1.0MPa左右，同时，伸长量和最大断裂强度也发生了明显变化。 利用硅橡胶作为微流控芯片的片基也存在很多问题。例如：1)硅橡胶强烈憎水，由于毛细张力，微管道很难被灌进水溶液，而一般的蛋白、肽、DNA等需要在水溶液状态下分离，这就需要施加很大的压力把水溶液压进管道，而这个压力可能往往把管道冲开；2)硅橡胶表面容易吸附蛋白、肽、DNA以及一些有机成分，从而造成交叉污染，给分离带来困难。解决这些问题的关键是在硅橡胶进行亲水性处理。由于硅橡胶非常稳定，一般的方法很难起到良好作用。目前，一般的处理方法是：在硅橡胶表面利用等离子、微波、紫外光等辐射，这些方法也可以到达一定的亲水效果，但很短暂，而且，表面常常会产生一些氧化硅的颗粒，使得表面粗糙不堪。还有一些方法如气相沉积、硅烷化处理等等也相继被采用。我们对硅橡胶亲水改性也作了尝试： (2)我们首先合成了三种烯基聚乙二醇。然后，依靠非等比混合，我们得到了表面富含聚氢基硅氧烷基团的硅橡胶，并将它置于烯基聚乙二醇的溶液中。利用Speier和Karstedit两种催化剂，催化烯基聚乙二醇同硅氢基的反应。反应的结果是在硅橡胶表面覆盖了一层聚乙二醇单分子膜，这层聚乙二醇膜改变了硅橡胶表面的憎水情况，同时，也使得硅橡胶表面对蛋白的吸附大大降低。 第二部分：单晶硅这里的单晶硅涉及n型和p型硅，与它们相关的不同晶向，如111晶向和100晶向的不同导电能力的单晶硅。考虑到平面硅表面的官能团太少，难于表征，本文中的叙述集中在多孔硅上。多孔硅按照孔径大小可以分为三种：大孔硅(孔径大于50nm)、亚孔硅(孔径介于10～50 nm之间)、微孔硅(孔径小于10 nm)。从孔的形状来说可分网状、筒状，以及介于网状和筒状之间的形状。采用不同的腐蚀方法会得到不同形状的多孔硅，例如：我们利用微孔硅研究多孔硅的发光、利用筒状亚孔硅作为蛋白的衬底。本论文利用5种晶体硅制备多孔硅。 (3)在本论文中，通过改变电流密度、改变HF浓度、改变光照条件、添加有机溶剂，调节电解液pH值等手段探索了大孔硅、亚孔硅、微孔硅的制备方法。同时利用透射红外、全反射衰减红外监控了表面官能团，如Si—H、Si—OH、Si—O—Si的变化。 目前，多孔硅已经在光刻、发光、3D硅基二极管、硅基化学生物传感器、硅基蛋白质组学等诸多领域显示出强大的优越性。但是表面含有Si—H或者Si—OH官能团的多孔硅片基不能稳定处于HF、碱性等环境。倘若置于其间，多孔层会被剥落溶解。因此，我们采用多孔硅表面进行有机单分子膜的处理来钝化多孔硅。有机双功能交联剂单分子膜不仅可以起到钝化多孔硅的作用，而且，还可以将生物分子如蛋白，DNA嫁接在表面。蛋白嫁接后的多孔硅有望在蛋白质芯片、基因芯片、生物印章、蛋白质组学等领域发挥作用。 (4)本论文研究了多种单分子膜的制备方法。利用11-烯酸在微波下同端Si—H的多孔硅反应，在多孔硅表面生成一层羧酸单分子膜，这层单分子膜钝化了多孔硅，使得多孔硅可以经受浓碱以及浓HF腐蚀。 (5)利用溴代羧酸在微波下直接嫁接羧酸单分子膜的途径，然后在NHS/DCC的激活下，牛血清蛋白和溶菌酶先后被共价嫁接在多孔硅表面。 由于多孔硅容易吸附蛋白，生物兼容性不好，不能直接用于体内。所以，多孔硅作为生物材料还需要进行表面改性处理。 (6)如上(2)所述，分别在微波和催化剂作用下，在多种多孔硅表面嫁接聚乙二醇单分子膜，改善了多孔硅的生物兼容性，同时，也减少了非特异性吸附蛋白的数量。由于上述蛋白是通过共价键嫁接在多孔硅表面，蛋白的活性位点被部分的掩盖，从而使嫁接的蛋白的活性较低。为了提高固定蛋白的活性，我们采用了蛋白质亲和分离的原理，设计实验将组氨酸标记蛋白固定在多孔硅表面。 (7)首先用11-烯酸同NH2-NTA反应生成CH2=CH2-(CH2)8-CONH-NTA。紫外光下，将之与端Si—H的多孔硅反应，结果在多孔硅表面生成一层NTA的单分子膜。由于NTA可以同过渡金属如Ni2+鳌合，水溶液鳌合之后，仍然有两个配位环境被水分子占据，组氨酸标记蛋白上咪唑容易取代水分子。这样，将NTA—多孔硅先后置于Ni2+水溶液和组氨酸标记蛋白的PBS中，蛋白就被固定在多孔硅表面。 近年来，利用激光基质辅助质谱(MALDI-TOF—MASS)来解析蛋白序列潜力很大，而多孔硅可以用作MALDI-TOF—MASS的片基。我们希望方法(7)中固定的蛋白能够用于MALDI-TOF—MASS分析。目前，这个工作仍在继续。