高密度养殖是集约化养殖模式的主要特点,在鱼类养殖生产过程中,过高的养殖密度可对鱼类造成拥挤胁迫。长期的拥挤胁迫不仅增大鱼类遭受机械损伤的机率,还会显著影响鱼类神经内分泌水平,从而进一步影响鱼类正常的血液理化指标、抗氧化及应激水平、代谢水平以及免疫水平等,最终可能导致鱼类生长减缓,抵御病害能力下降,甚至发生病害和死亡。可见,由高密度养殖造成的慢性拥挤胁迫已成为影响集约化养殖条件下鱼类健康和福利水平的重要因素。大菱鲆(Scophthalmus maximus)是原产欧洲沿海的名贵经济鱼类,生长速度快、品质优良,是适宜集约化养殖的优选品种,现今已成为我国北方沿海工厂化养殖业的主导品种之一。近年来,随着大菱鲆养殖规模的快速扩大以及养殖环境的不断恶化,病害时有发生。迟钝爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)是大菱鲆多发疾病,迟缓爱德华氏菌是该病致病菌,常规化学药品不仅难以稳定有效的防治此类病害,还可能会导致食品安全问题的发生。接种疫苗是预防疾病爆发的有效手段之一。减毒迟钝爱德华氏菌活疫苗已在大菱鲆上被证实具有显著免疫保护效果,但不同免疫策略会直接影响疫苗的免疫效力。大菱鲆的主要养殖模式是工厂化,养殖密度相对较高,由此而来的拥挤效应对鱼类而言是一种长期的慢性胁迫。为保证疫苗接种的安全有效性,需要对大菱鲆在拥挤胁迫条件下的疫苗接种效果进行科学的评估;拥挤胁迫对大菱鲆接种迟钝爱德华氏菌减毒活疫苗免疫应答的影响及其机制研究亟待展开。本研究将大菱鲆放养于高、中、低三个密度组(HD,MD,LD),经接种减毒迟钝爱德华氏菌活疫苗后,利用酶联免疫、流式细胞仪术、现代分子生物学等技术手段,监测大菱鲆免疫相关因子的变化,基因的表达规律,阳性B细胞的动力学特征,并通过构建关键免疫器官比较转录组,分析拥挤胁迫对大菱鲆免疫应答的影响。主要研究结果和内容如下:1拥挤胁迫对大菱鲆血液生理参数及免疫基因表达的影响通过监测不同养殖密度组(LD:5kg/m2,MD:10kg/m2,HD:20kg/m2)中,接种疫苗大菱鲆的(Scophthalmus maximus)血液、脾脏、头肾、鳃和皮肤中免疫指标变化规律,研究经接种疫苗操作后大菱鲆应对拥挤胁迫的应激响应。结果显示:血液中,LD组大菱鲆白细胞介素(1L-1β)、补体(C3)、免疫球蛋白M(IgM)、溶菌酶(LZM)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等免疫指标显著高于MD、HD组(P<0.05),通过基因表达分析发现LD组大菱鲆鳃组织中的主要组织相容性复合体(MHCⅡ)表达量显著高于MD、HD组(除了免疫后第三周);LD组鳃中的IL1 β表达量也高于MD、HD密度组;LD组皮肤中TNF-α的表达量高于MD、HD同组织中的含量。2.拥挤胁迫对大菱鲆特异性免疫应答的影响通过监测不同养殖密度下大菱鲆阳性B淋巴细胞,特异性抗体IgM以及皮质醇含量的变化,研究拥挤胁迫对大菱鲆特异性免疫应答的影响。接种疫苗后,用流式细胞术检测大菱鲆血液,脾脏以及头肾中阳性免疫球蛋白(sIg+)的含量,结果表明,HD组sIg+细胞含量在免疫后第六周达到峰值,比低密度组和HD组峰值出现时间晚了一周。另外HD组大菱鲆在血液、脾脏和头肾中的sIg+细胞含量高峰值(血液41.37±3.18%,脾脏29.6±2.34%,头肾22.37±1.76%)显著低于 MD(血液46.73 ±3.18%,脾脏 33.28±2.68%,头肾24.57±2.32%,P<0.05)和 LD(血液 53.14±3.25%,脾脏 38.36±3.54%,头肾28.13±3.456%,P<0.05)。同时所有实验组大菱鲆特异性抗体含量在免疫后均开始上升,LD和MD在免疫后第5周达到峰值,而HD组的特异性抗体在第6周达到峰值。HD组皮质醇含量在最后3-4周时间里远高于MD和LD。整个结果表明,在低密度养殖条件下大菱鲆能够获得更好的免疫效果。同时我们发现HD组大菱鲆对于接下来的免疫刺激的反应能力有所下降。3.大菱鲆脾脏转录组数据分析为系统了解拥挤胁迫对大菱鲆免疫应答影响的转录组特征,我们选取了HD组和LD免疫后第5周的脾脏,共构建了 6个cDNA测序文库,进行了 RNA-seq测序及生物信息学分析。测序共得到447,000,000条平均长度为1274bp的序列。经过小片段去除和质量筛查后,共获得94%的高质量序列。这些高质量的序列经过拼接得到41,136unigenes。将得到的41136条Unigenes与NCBI的Nr经blast比对,其中22806条获得同源序列注释,占总数的55.44%,再将全部获得序列依次与Swissprot、KOG和KEGG数据库进行比对。经四大数据库比对后,共有22931条Unigenes获得了注释,占总数的55.74%。为了进一步了解转录组数据的完整性,对获得的41136个Unigenes进行了 COG功能注释。41136条Unigenes被注释到26个不同功能家族中,经比对发现涉及Signal transduction mechannisms功能的基因最多有7901条 Unigenes,其次是 General function prediction only 功能有 6112 条 Unigenes,然后 Posttranslation modification 功能有 3216 条 Unigenes 涉及为了进一步对Unigenes描述,对于获得的Unigenes进行GO注释。41136条Unigenes被注释到GO数据库中细胞组分、生物学过程和分子功能三大类55个分类中。其中生物学过程占了 23类,细胞组分占了 20类,分子功能占了 12类。在生物学过程中关于cellular process Unigenes最多为6462条,占15.7%。细胞组分中cell和cell part均占4630条Unigenes,占总的11.3%。分子功能中bing类有7120条Unigenes,占比最多为17.3%。利用RPKA值差异显著性(P<0.05)计算两组基因表达量,并用2-fold法进行数据统计和分析不同密度组之间的差异基因。总共获得397个差异表达基因,其中146个基因显著上调,251个基因显著下调。对大菱鲆脾脏转录组的测序,将有助于大菱鲆免疫组学相关研究工作的开展。4.大菱鲆头肾差异表达基因转录组数据分析经转录组测序后,将各样品所获得的原始reads数据进行过滤,首先去除带接头(adopter)的reads,然后去掉无法确定碱基信息占比超过10%的reads,最后去掉低质量的reads得到clean reads。将clean reads进行拼接组装,HD组获得 40762 条 unigenes,LD40843 条 unigenes。以 LDunigenes 作为基准,利用 RPKA值差异显著性(P<0.05)计算HD组基因表达量,并用2-fold法进行数据统计和分析。总共获得758个差异表达基因,其中100个基因显著上调,658个基因显著下调,下调基因远高于上调基因数。将所有差异表达基因进行GO分析,这些基因分属于生物过程、细胞组分和分子功能三大类下的42个分支,且均以下调为主。生物过程组中含有19个分支,其中细胞过程(cellular process)、单组织过程(single-organism process)和代谢过程(metabolic process)占比最高分别为23.48%,20.32%和17.94%;细胞组分组中有13个分支,其中细胞(cell)、细胞组分(cell part)和细胞器(organelle)占比最高,分别为15.17%,15.17%和11.74%;在分子功能分组中有10个分支,其中结合(binding)、催化活性(catalytic activity)和分子传导活性(molecular transducer activity)占比最高,分别为30.21%,18.47%和3.43%。差异表达基因的GO功能富集分析表明,拥挤胁迫下鱼体代谢和生物调控机能受到影响。通过 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路注释分析有助于我们了解基因产物、生物学功能、代谢途径以及酶催化之间的联系。把差异表达基因序列与KEGG数据库中的数据进行blastx比对注释,结果表明758个差异表达基因涉及KEGG新陈代谢(Metabolism),遗传信息加工(Genetic Information Processing),环境信息加工(Environmental Information Processing),细胞过程(Cellular Processes)以及生物体系统(Organismal Systems)五大类的125个通路。其中p<0.05的显著差异通路有血管平滑肌收缩(Vascular smooth muscle contraction)、cGMP-PKN 信号通路(cGMP-PKG signaling pathway)、Rapl信号通路(Rapl signalingpathway)等14条通路,p<0.01的极显著差异通路有6条分别为焦点粘连(focal adhesion),黏着连接(adherens junction),FoxO信号通路(FoxO signaling pathway),黑色素生成(Melanogenesis),ErbB 信号通路(ErbB signaling pathway)以及刺猬信号通路(Hedgehog signaling pathway)。对大菱鲆脾脏转录组的测序,将有助于大菱鲆免疫组学相关研究工作的开展。5.大菱鲆IL-4/13的鉴定与表达分析通过RT-PCR技术以及RACE技术获得IL-4/13基因的全长cDNA 1333bp,开放阅读框435bp,编码144个氨基酸,其中前端21个氨基酸经SignalP 4.1预测为信号肽,其余的123个氨基酸为成熟肽。构建进化树,结果表明大菱鲆IL4/13基因与鲈鱼的IL-4/13-2基因聚为一枝。设计荧光定量PCR引物在大菱鲆心、脾、肠、头肾、皮、肌、脑、肝及鳃中进行表达,发现在心、脾、肠和头肾中表达量较高。免疫注射发现,在免疫后各组织中表达含量均明显上升,说明IL-4/13在大菱鲆免疫应答中起重要作用;但是在不同密度组之间,各相同组织中表达量没有显著差异,说明拥挤胁迫对IL-4/13基因的表达没有显著影响。大菱鲆IL-4/13基因的获得为大菱鲆免疫的研究提供了一定的基础信息支持。