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研究背景:结直肠癌的远处转移是导致患者治疗失败和死亡的重要因素之一,血道和淋巴道是其形成远处转移的重要途径。其中血管与肿瘤关系已有较深入的研究,然而长期以来,由于缺乏淋巴管特异性标记物,使得对肿瘤淋巴管生成的研究明显滞后于血管生成的研究。D2-40为新近发现标记淋巴管的单克隆抗体,其特异性和敏感性均高,不标记血管内皮细胞,故可用于淋巴管(lymph vessel,LV)计数。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)是肿瘤组织中浸润的巨噬细胞,其在肿瘤的生长、侵袭、转移和复发中扮演了重要的角色。目前对TAM与血管新生的关系研究较多,认为其能促进血管新生。TAM与肿瘤新生淋巴管的研究则较少,可能的原因之一是缺乏标记淋巴管的特异性抗体。本实验应用新的特异性淋巴管抗体(D2-40),采用免疫组织化学的方法,检测人结直肠癌组织中LV、TAM的表达,研究结直肠癌淋巴管生成与TAM的关系,探讨肿瘤淋巴管生成的机制。材料与方法:1、临床标本:人结直肠病变组织标本48例取自1998年12月至2000年12月广州医学院第二附属医院普外科手术或肠镜下切除并经病理证实的存档石蜡。另13例正常结直肠组织为结直肠癌手术时距肿瘤组织5cm以上,经病理HE染色证实的正常结直肠组织。患者术前均未行化疗或放疗。其中结直肠癌32例,结直肠良性病变组织16例。结直肠癌中男性18例,女性14例;年龄38~93岁,平均62.3岁。有淋巴结转移17例,无淋巴结转移15例。16例良性病变组中息肉9例,腺瘤7例;男性6例,女性10例;年龄3.5~81岁,平均54.7岁。2、抗体和试剂盒:标记淋巴管的鼠抗人单克隆抗体D2-40(即用型),购于Invitrogen公司。D2-40染色所需的鼠SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术公司。巨噬细胞标记物CD68的单克隆抗体PG-M1(1:100),购自DAKO公司。CD68染色过程中所需的SP-2001试剂盒、二抗试剂盒、DAB试剂盒均购自美国Vector公司。所有切片均设阳性及阴性对照,并进行常规HE染色。3、染色结果的判定及细胞计数方法: D2-40阳性细胞定位于淋巴管上皮细胞胞膜,呈棕黄色。微淋巴管的计数标准是每个阳性染色的内皮细胞、内皮细胞簇或单个小脉管均视为1个微淋巴管。参考Weidner的方法先在100倍视野下选择5处阳性细胞最密集区,然后在200倍视野下计数,分别计算出每份标本的平均值。CD68阳性细胞染色位于细胞膜,呈铁锈色。参考Leek的方法先在低倍视野下选择5处阳性细胞最密集区,然后在400倍视野下进行计数,然后分别计算出每份标本的平均值。4、统计学分析:应用SPSS11.5统计分析软件包对数据进行方差分析、t检验及Spearman等级相关分析,当P<0.05时,认为有统计学意义。结果:1、免疫组织化学染色形态学表现:D2-40抗体标记的结直肠淋巴管阳性细胞呈棕黄色,主要分布于间质中,呈圆形或类圆形及条索状。结直肠病变组织的淋巴管数量比正常结直肠组织的淋巴管多。CD68标记的结直肠癌肿瘤相关巨噬细胞的阳性细胞呈铁锈色,主要分布于癌间质及癌巢间。D2-40标记的结直肠癌淋巴管主要分布在肿瘤周边区,数量多、管腔较大,呈扩张状,而在癌巢间或癌组织内存在稀少甚至没有,癌组织内的淋巴管呈条索或闭锁状态。连续切片染色发现淋巴管与肿瘤相关巨噬细胞分布几乎一致,均分布在癌间质,癌细胞未被阳性染色。2、免疫组织化学染色细胞计数分析:结直肠癌、结直肠良性病变组的LV计数明显高于正常结直肠组的LV,均有统计学意义(P<0.001)。结直肠癌有淋巴结转移组的LV计数高于无淋巴结转移组,差异有统计学意义(P<0.05)。结直肠癌TAM计数高于结直肠良性病变组TAM计数,差异有统计学意义(P<0.05)。3、LV与TAM计数的相关性分析:经Spearman等级相关分析,结直肠癌组中LV计数与TAM计数呈正相关(r=0.58,P<0.01);有淋巴结转移组LV计数与TAM计数呈正相关(r=0.66,P<0.01);无淋巴结转移组TAM计数与LV计数呈正相关(r=0.56,P<0.05)。良性病变组织中,LV计数与TAM计数呈密切负相关(r=-0.66,P <0.01)。4、LV和TAM计数与患者生存期的关系:32例结直肠癌患者中,有25例随访结果完整,其中已死亡病例23例,仍健在的2例。术后最短生存时间为5天,最长生存时间128.7个月,平均生存时间为72个月。经统计学分析,结直肠癌患者中LV计数与生存月数呈负相关(r=-0.53,P <0.01);结直肠癌患者中TAM计数与生存月数呈负相关(r=-0.65,P <0.01)。结论:结直肠癌和良性病变组织中,有新生淋巴管的形成。结直肠癌患者中,TAM可能促进肿瘤淋巴管生成,进而可能促进肿瘤淋巴结的转移;结直肠良性病变组织中,TAM可能起到抑制淋巴管生成的作用。