肝纤维化(hepatic fibrosis， HF)是以胶原为主的细胞外间质(extracellular matrix， ECM)成分在肝内过多沉积所致。在肝脏受到慢性损伤时，纤维组织生成，如果不及时去除刺激因素，纤维组织则持续增生，从而形成肝硬化。肝纤维化是肝硬化发生发展的必经途径，肝纤维化是可逆的，而肝硬化则难以逆转。因此，研究肝纤维化的发病机制，从而阻断甚或逆转肝纤维化非常关键。　　 肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝脏窦状隙周围细胞，正常情况下处于静止状态，炎症、损伤等因素可以使其激活，产生大量以胶原为主的ECM成分和各种细胞因子。HSC是肝脏主要的纤维生成细胞，其活化、增殖可以启动整个肝纤维化过程，是肝纤维化形成的中心环节。HSC活化后难以恢复静止状态，肝脏主要通过细胞凋亡机制来去除活化HSC，而这恰是肝纤维化发生逆转的关键所在。因此，抑制HSC活化、增殖，诱导活化的HSC凋亡对逆转肝纤维化意义重大。　　 第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)是迄今发现的第一个具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，其缺失或表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来，对PTEN的研究已从肿瘤领域逐渐延伸至非肿瘤领域。我们的前期研究发现在胆总管结扎(bile duct ligation， BDL)大鼠肝纤维化模型中，PTEN与在体大鼠HSC活化、增殖呈负相关，与HSC凋亡呈正相关。而PTEN在肝纤维化逆转中的表达改变尚未见报道，本研究旨在阐明PTEN在肝纤维化发病以及自发逆转过程中的表达改变，并探讨其动态表达与HSC增殖、凋亡的关系，从而为寻求有效预防和逆转肝纤维化的新策略提供实验依据。　　 目的：研究PTEN在大鼠肝纤维化及自发逆转过程中的表达改变及其与在体HSC增殖、凋亡的关系。　　 方法：使用成年健康雄性Wistar大鼠108只，随机分为模型组(30只）、模型对照组(30只)、逆转组(24只)、逆转对照组(24只)，进行四肢轮流皮下注射40％CCl4橄榄油溶液（2ml·kg-1，2次/周）共5周建立大鼠肝纤维化模型，模型建立成功后停止应用CCl4并正常饲养4周建立肝纤维化自发逆转模型，正常大鼠作为对照组，造模过程中大鼠无死亡。利用Haematoxylin and eosin staining（H&E染色）、Massons trichrome staining（MT染色）方法观察肝脏病理学改变，免疫荧光方法检测大鼠肝组织中PTEN及α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表达；采用免疫荧光双标记法利用激光扫描共聚焦显微镜测定在体活化HSC以及凋亡细胞中PTEN的表达改变；末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(TUNEL)及α-SMA免疫荧光双标记方法检测在体活化HSC的凋亡；Western blot和real-time fluorescent quantitation PCR(real-time PCR)检测PTEN蛋白及mRNA在大鼠肝组织中的表达。　　 结果：①H&E和MT染色结果显示：CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型和自发逆转模型成功建立，随着CCl4用药时间的延长，肝细胞变性坏死逐渐增多，大鼠肝纤维化程度逐渐加重；在停止注射后，随着自发逆转时间延长，已形成的纤维组织逐渐减少，肝细胞逐渐恢复正常形态，再生肝细胞增多；②α-SMA免疫荧光染色显示：对照组正常大鼠肝组织中，α-SMA仅在血管壁平滑肌细胞有表达，造模1wk、2wk、3wk、4wk和5wk时大鼠肝组织内α-SMA的累积阳性光密度值(0.51±0.02，0.74±0.02，1.29±0.02，1.40±0.01，1.65±0.02)均显著高于对照组(0.07±0.01)，P＜0.01;且各组之间均有显著性差异(P＜0.01)；而在自发逆转组，随着自发逆转时间的延长，造模Re1 wk、Re2 wk、Re3 wk和Re4 wk免疫荧光结果显示α-SMA阳性表达(1.31±0.11，1.14±0.03，0.97±0.01，0.55±0.11)逐渐降低，但仍显著高于对照组(0.12±0.04)，并且各组之间有显著性差异，P＜0.01；③PTEN免疫荧光染色显示：正常大鼠肝组织中PTEN蛋白广泛表达于细胞浆，随肝纤维化进展，PTEN阳性细胞主要分布于纤维间隔、汇管区及增生的胆管周围细胞处。造模1wk、2wk、3wk、4wk及5wk大鼠肝组织内PTEN蛋白的阳性光密度值逐渐降低(2.23±0.02，1.96±0.03，1.61±0.02，1.37±0.02，0.98±0.01)并显著低于对照组(2.67±0.02)，P＜0.01;各组之间均有显著性差异(P＜0.01)。在逆转组，随着停药时间的延长，PTEN蛋白表达逐渐回升(1.01±0.11，1.46±0.09，1.62±0.22，1.99±0.30)，由汇管区表达增加逐渐广泛表达于肝小叶其它部位，但仍低于对照组(2.31±0.12)，各组之间具有显著性差异，P＜0.01;④Western blot分析显示，造模1wk、2wk、3wk、4wk及5wk大鼠纤维化肝组织中PTEN蛋白表达量(1.33±0.10，1.12±0.13，0.83±0.10，0.55±0.08，0.41±0.09)，均显著低于对照组(1.75±0.32)，P＜0.01;且各组之间比较也均有显著性差异(P＜0.01），即大鼠肝纤维化越重PTEN蛋白表达越低。在逆转组，造模Re1 wk、Re2 wk、Re3 wk及Re4 wk中PTEN蛋白表达量(0.10±0.03，0.21±0.05，0.36±0.08，0.44±0.06)，呈逐渐升高的趋势，且各组之间具有显著性差异(P＜0.01）；⑤应用实时荧光定量PCR，采用相对定量2-△△Ct法比较PTEN mRNA在各组大鼠肝组织中的表达，造模1wk、2wk、3wk、4wk及5wk肝组织中PTEN mRNA相对对照组的表达倍数为0.67±0.01，0.58±0.04，0.48±0.02，0.38±0.04，0.28±0.08，均显著低于对照组，并随肝纤维化的加重而逐渐降低，P＜0.01。而在逆转Re1 wk、Re2 wk、Re3 wk及Re4 wk中，PTENmRNA的相对表达倍数分别为0.53±0.01，0.74±0.01，0.80±0.03，0.93±0.06，仍低于对照组，各组之间均有显著性差异，P＜0.01;⑥PTEN和α-SMA在HSC的共表达产物，主要存在于活化HSC细胞浆，并且共表达区域以汇管区和纤维结缔组织区域为主，共聚焦激光扫描显微镜图像分析结果显示，造模1wk、2wk、3wk、4wk及5wk大鼠肝组织中PTEN表达阳性的活化HSC占总的活化HSC的比例分别为(0.90±0.05，0.75±0.03，0.41±0.03，0.29±0.02，0.23±0.03)。即随着肝纤维化的进展，活化HSC中PTEN表达逐渐降低。在逆转Re1 wk、Re2 wk、Re3 wk及Re4 wk组中，活化HSC中PTEN表达逐渐上升，并且具有显著性差异(0.35±0.02，0.57±0.02，0.66±0.02，0.71±0.02)(P＜0.01);⑦TUNEL及α-SMA免疫荧光双重染色显示：正常大鼠肝组织未见凋亡HSC，随肝纤维化程度加重，活化HSC增多，凋亡HSC也随之增多，造模1wk、2wk、3wk、4wk及5wk，大鼠肝组织活化HSC凋亡指数(7.12±0.03，6.35±0.02，4.11±0.02，3.68±0.02，1.50±0.03)显著高于对照组，随着肝纤维化病变加重，活化HSC凋亡的比例逐渐减少(P＜0.01)。而停药后，随着肝纤维化的自发逆转，活化HSC的凋亡指数显著增加(1.20±0.23，1.35±0.12，4.20±0.17，6.51±0.45，P＜0.01)，凋亡的活化HSC主要集中在汇管区及纤维组织区域；⑧共聚焦激光扫描显微镜下观察TUNEL及PTEN免疫荧光双重染色的大鼠肝组织冰冻切片，正常大鼠和模型1wk组大鼠肝组织未见凋亡细胞，随肝纤维化程度加重，造模2wk、3wk、4wk及5wk可见凋亡细胞逐渐增多，PTEN阳性的凋亡细胞比例逐渐降低(0.70±0.01，0.64±0.01，0.50±0.02，0.33±0.01)，P＜0.01。而在逆转组，PTEN阳性的凋亡细胞和凋亡细胞进一步增多，其比例在Re1 wk、Re2 wk、Re3 wk及Re4 wk中逐渐升高(0.78±0.02，0.80±0.01，0.92±0.02，0.95±0.02)；⑨对PTEN免疫荧光染色结果与α-SMA免疫荧光染色结果、PTEN阳性的活化HSC比例、活化HSC凋亡指数及PTEN阳性的凋亡细胞比例进行Pearsons相关性分析，结果显示，大鼠纤维化肝组织中PTEN表达与α-SMA的表达呈显著性负相关，与PTEN阳性的活化HSC比例呈显著性正相关，与活化HSC凋亡指数呈显著性正相关，与PTEN阳性的凋亡细胞比例呈显著正相关，r值分别为-0.979、0.962、0.991、0.979,P＜0.05。　　 结论：CCl4诱导的大鼠肝纤维化病变进展中肝组织及其HSC的PTEN表达下调，而停药后的自发逆转进程中肝组织及HSC的PTEN表达上调，提示PTEN可能通过抑制HSC的活化、增殖和诱导活化HSC发生凋亡而成为治疗肝纤维化的新靶点。