研究背景葡萄膜黑色素瘤(uvealmelanoma,UM)好发于眼球后极部,是成年人眼内最常见的原发性恶性肿瘤。UM极易发生血行转移,大约50%的UM患者在首次就诊时被检查发现远处转移病灶,近一半转移性UM患者的肝脏均有不同程度受累。UM一旦发生转移,患者死亡率极高,据临床研究数据统计发现,转移性UM患者的中位生存期仅为5-8个月。UM传统治疗方法为眼球摘除术,但是由于该方法创伤大,导致患者日常生活质量受到严重的影响。近年来,逐渐出现了多种保留眼球的新型治疗策略,包括局部肿瘤切除术、局部放射治疗和激光光凝等。尽管这些新兴的治疗手段保留了UM患者眼球、维持了患者部分视功能,但是流行病学统计发现,近年来UM患者总生存率并未能得到有效的改善。近年来,特异性分子靶点在多种人类恶性肿瘤中的潜在应用前景逐渐引起学者们的关注,主要包括肿瘤早期诊断、临床治疗及预后评估等方面,分子生物靶点可能作为一种新型且疗效显著的肿瘤临床治疗新模式。研究发现,高迁移率族蛋白家族分子是调控肿瘤恶性表型的重要蛋白家族,其中高迁移率族蛋白A1(high-mobility group A,HMGA1)能够启动多个肿瘤发生并促进肿瘤进展,HMGA1的作用机制涉及与非编码RNA、信号通路之间的关系。HMGA1在人类正常或高分化的肿瘤组织内呈低表达甚至缺如,而在低分化肿瘤中常为高表达。由此推测,干预HMGA1表达即有可抑制UM肿瘤细胞生长、转移、侵袭等细胞生物学功能,而且这种干预对宿主正常细胞的影响较小,从而有效提高抗肿瘤效应对人体的安全性。课题组前期研究发现,HMGA1在UM患者肿瘤组织中呈高表达,并且与UM肿瘤远处转移率升高和UM患者中位生存期缩短呈正向相关。故阻断HMGA1相应的信号通路,即有可能阻断HMGA1所控制的相应肿瘤活动。MicroRNA(miRNA)又称为微小RNA,是一类具有调控功能的非编码RNA。近年来,miRNAs的调控机制逐渐成为抗肿瘤及抗肿瘤远处转移的研究热点。已有多项研究报道了 miR-222在不同类型恶性肿瘤中的异常表达,例如肺癌、宫颈癌及肾透明细胞癌等,但是miR-222与HMGA1在UM肿瘤中的作用机制目前尚未有相关文献报道。故本课题拟从HMGA1对UM细胞的调控机制和miR-222与HMGA1在UM中的作用机制入手,探讨HMGA1与miR-222对UM细胞增殖和迁移等重要生物学功能的调控机制,为临床治疗提供数据及潜在的分子治疗靶点。已有研究证实,PI3K/Akt/MMP-9是HMGA1的下游信号通路。其中,基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)可通过降解肿瘤细胞外基质(extracellular matrix,ECM),使肿瘤细胞摆脱ECM的束缚而产生浸润和转移。若能实现靶向下调PI3K/Akt/MMP-9通路或其上游的HMGA1,抑制肿瘤组织中MMP-9过表达所诱导的肿瘤细胞浸润效应,阻断其下游迁移和侵袭信号可能是最有希望取得良好抗肿瘤及抗肿瘤转移疗效的策略。目前尚未有文献报道过,在UM中HMGA1与miR-222对肿瘤细胞的调控机制。故我们拟从HMGA1与miR-222在UM中的相互作用关系,及其是否通过PI3K/Akt/MMP-9通路实现对UM细胞的生物功能调控等方面来验证,为临床早期诊断、临床治疗及患者预后评估提供真实有效的实验数据及潜在的生物靶点。第一部分HMGA1在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达目的:HMGA1属于高迁移率族蛋白家族,是调控肿瘤恶性表型的重要蛋白,可以启动人类多种恶性肿瘤的发生并促进肿瘤进展。HMGA1的主要作用机制为参与下游基因及信号通路的调控,对肿瘤发生进展中的肿瘤血管新生、细胞增殖、凋亡异常、微环境改变、炎症反应及远处转移等一系列病理过程均有调节作用。设想若能人为阻断HMGA1对应的相关信号通路,即有希望阻断HMGA1所控制的相应肿瘤活动。课题组前期通过分析89例UM患者肿瘤组织中的HMGA1表达,发现HMGA1在UM组织中呈现过表达状态,且与UM远处转移的发生率及患者中位生存期缩短相关。课题的第一部分旨在检测UM细胞C918和MUM-2B中HMGA1的表达情况,为探究HMGA1在UM中的调控机制奠定基础。方法:收集UM细胞C918和MUM-2B,实时荧光定量PCR反应(quantitative realtime polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞样本中 HMGA1 表达。结果:相比于正常对照组细胞,HMGA1表达在C918及MUM-2B细胞中显著升高(P<0.05)。结论:HMGA1表达在UM细胞C918和MUM-2B中升高明显,提示HMGA1可能在UM进展过程中发挥着重要作用。第二部分葡萄膜黑色素瘤中HMGA1对PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用目的:在第一部分研究结果中,我们发现了 UM细胞及组织中存在着HMGA1的过表达现象,且HMGA1的过表达状态与UM肿瘤细胞高转移率及患者中位生存期缩短相关。然而,HMGA1在UM中的调控机制如何?目前尚未解决。在本部分内容中,我们旨在研究分析HMGA1对UM细胞功能调控的具体作用机制;验证HMGA1作为上游分子信号,对下游通路PI3K/Akt/MMP-9的调控作用。方法:利用慢病毒包装的lentivirus(LV)-HMGA1-RNAi下调C918与MUM-2B两种人UM细胞的HMGA1基因表达。细胞转染后48h,荧光显微镜下观察增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的UM细胞数量,评估转染效率,有荧光标记的细胞表示病毒已经转入细胞并成功表达。更换新鲜细胞培养液,加入嘌呤霉素进行两周左右的细胞筛选,从而得到慢病毒成功转染的UM细胞C918和MUM-2B。提取UM细胞总RNA及总蛋白质,采用RT-PCR及Western blot技术检测LV-HMGA1转染组及LV-NC组中HMGA1及PI3K/Akt/MMP-9通路信号的表达差异。结果:荧光显微镜检测结果显示,C918细胞的病毒转染率达90%以上,MUM-2B转染率为80%左右。慢病毒转染72h后,提取细胞总RNA及总蛋白,RT-PCR结果显示在C918与MUM-2B细胞中,与NC组相比,HMGA1及MMP-9表达水平在LV-HMGA1转染组中明显下调(P<0.05);Western blot结果显示,在C918与MUM-2B细胞中,HMGA1、p-PI3K、p-Akt与MMP-9的表达在LV-HMGA1转染组中显著下降,与 RT-PCR结果一致(P<0.05)。结论:HMGA1过表达状态是UM肿瘤进展的高危因素。通过应用慢病毒下调HMGA1表达后,RT-PCR及Western blot结果均显示,HMGA1表达的抑制可有效下调PI3K/Akt/MMP-9通路信号,从而达到抑制UM肿瘤生长的目的。由此可见,HMGA1可能通过调控PI3K/Akt/MMP-9通路,参与了 UM细胞增殖、迁移及侵袭等恶性表型,揭示HMGA1表达调控机制可为有效抑制UM病程进展和远处转移提供新的临床诊疗思路。第三部分MicroRNA-222对葡萄膜黑色素瘤细胞生物学功能的影响目的:探讨MicroRNA-222(miR-222)表达水平改变对UM细胞活性、凋亡及迁移等细胞生物学功能的影响。方法:成功构建 miR-222-3pmimics,miR-222-3p inhibitor和其分别对应的 miRNA-222-3p negative control(miRNA-222-3p NC),与 EndoFectinrM Max 转染试剂混合后分别转入C918与MUM-2B两种UM细胞中,改变细胞内miRNA-222-3p的表达水平,从而观察分析UM细胞增殖活性(CCK-8实验)、迁移能力(Transwell小室和细胞划痕实验)及凋亡状态(Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒)。通过以上实验,综合分析miR-222对UM细胞的调控作用。结果:将miR-222-3p mimics,miR-222-3p inhibitor和其对应的NC组分别利用转染试剂转入C918与MUM-2B细胞后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测UM细胞中miR-222-3p表达水平变化,以评估转染效果。RT-PCR结果显示,通过miR-222 mimics或miR-222 inhibitor转染UM细胞,miR-222表达水平在C918与MUM-2B细胞中出现显著的上调或下调,提示表达干扰效果较好(P<0.05)。通过分析CCK-8结果发现,miR-222 mimics能够显著提高UM细胞的增殖活力,相反,在miR-222 inhibitor转染组中,C918与MUM-2B细胞的增殖能力受到了明显抑制(P<0.05)。Annexin V-FITC凋亡检测结果显示,C918与MUM-2B细胞在miR-222-3pmimics转染组中,Annexin V阳性染色细胞较少;而在miR-222 inhibitor转染组中,Annexin V阳性染色细胞数量显著增多(P<0.05)。分析细胞划痕与Transwell实验结果后均提示,miR-222 mimics转染组中的UM细胞迁移能力较miR-222 inhibitor转染组中的细胞明显增强(P<0.05)。综上所述,miR-222在UM细胞中发挥着促进肿瘤细胞增殖和迁移的作用。结论:MiR-222对UM细胞C918与MUM-2B有着促进细胞增殖和迁移、抑制细胞凋亡的作用,可见在UM中miR-222发挥着癌基因的效应。第四部分葡萄膜黑色素瘤中HMGA1靶向miR-222对PI3K/Akt/MMP-9通路调控的机制研究目的:在第三部分研究内容中,我们发现了 miR-222对两种UM细胞C918与MUM-2B有着抑制细胞凋亡、促进细胞增殖及迁移的能力,可见miR-222发挥着促进UM肿瘤生长及进展的作用。在这一部分研究中,我们将深入分析UM肿瘤中miR-222与HMGA1的作用关系,及miR-222对下游PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用。方法:利用慢病毒LV-HMGA1-RNAi下调C918与MUM-2B细胞中HMGA1表达后,RT-PCR检测HMGA1表达下调组和LV-NC组中miR-222表达水平改变。构建miR-222-3p mimics,miR-222-3p inhibitor 和其对应的 miR-222-3p NC,在转染试剂的辅助下进入C918与MUM-2B细胞中,上调或下调UM细胞内miR-222-3p表达水平;转染48h后,Western blot检测不同转染组中PI3K/Akt/MMP-9通路信号表达情况;并利用生物学网站进行miR-222与HMGA1的作用靶点预测。结果:通过RT-PCR检测C918与MUM-2B细胞中miR-222水平,结果发现在HMGA1表达下调组中,C918与MUM-2B细胞中miR-222表达水平显著降低(P<0.05)。在miR-222-3p mimics 转染组中,Western blot 检测发现,C918 与 MUM-2B 细胞中的 p-PI3K,p-Akt与MMP-9蛋白表达均显著上调;相反,在miR-222-3p inhibitor转染组中,p-PI3K,p-Akt与MMP-9蛋白表达下降(P<0.05),但PI3K与Akt总蛋白水平在miR-222-3p mimics和inhibitor组中并无明显差异。我们推测,出现此结果的原因可能为磷酸化的PI3K与Akt(即p-PI3K,p-Akt)分别是PI3K与Akt的活化形式,所以p-PI3K和p-Akt的表达水平在不同转染组中发生了明显变化,而总PI3K与总Akt蛋白表达则较为稳定。结论:在UM肿瘤中,HMGA1与miR-222之间可能存在着作用靶点;miR-222发挥着促进UM肿瘤细胞增殖、迁移等作用,且miR-222对UM细胞的调控作用可能是通过PI3K/Akt/MMP-9通路介导的。第五部分HMGA1对葡萄膜黑色素瘤细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究目的:通过慢病毒LV-HMGA1-RNAi构建HMGA1表达稳定下调的C918细胞,并使C918细胞悬液通过皮下注射方式进入裸鼠体内成瘤,观察HMGA1对UM肿瘤生物学行为影响;通过分子蛋白水平检测分析动物瘤体组织中HMGA1表达对PI3K/Akt/MMP-9通路的调控作用。方法:将成功构建的HMGA1表达稳定下调的C918细胞皮下注射入裸鼠体内成瘤后,观察HMGA1表达下调组和NC组中裸鼠体内UM肿瘤形成过程。注射后一周后,每两天记录裸鼠体重和瘤体体积。28天时处死裸鼠,测量瘤体重量和体积;收集部分瘤体组织提取总蛋白质,行Western blot检测HMGA1表达及PI3K/Akt/MMP-9信号通路表达水平在不同实验动物组的差异;另保留部分瘤体组织行免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)分析 HMGA1 表达。结果:裸鼠皮下成瘤实验证实,HMGA1表达下调组的裸鼠瘤体体积和重量显著小于NC组裸鼠,且其生长速度减缓(P<0.05)。保留部分瘤体组织,采用Western blot及IHC实验检测HMGA1和PI3K/Akt/MMP-9表达。结果显示,HMGA1表达水平在慢病毒LV-HMGA1-RNAi转染组中明显降低,证实了 HMGA1表达下调的C918裸鼠成瘤模型构建成功;与NC组相比,PI3K,p-PI3K,p-Akt及MMP-9表达水平在慢病毒转染组中均显著下降(P<0.05)。结论:裸鼠体内实验证实,HMGA1发挥着促进UM肿瘤生长的作用。当利用慢病毒下调C918细胞中HMGA1表达时,肿瘤生长受到明显抑制。通过分子生物学分析,我们证实了 HMGA1是通过PI3K/Akt/MMP-9通路发挥了在裸鼠体内调节UM细胞增殖的效应。全文结论HMGA1是UM发生及进展过程中的重要致癌基因,其在肿瘤组织中的过表达状态与UM细胞增殖、迁移、转移等生物学功能密切相关,揭示HMGA1表达及相关调控机制可为UM的临床治疗提供新的诊疗思路和分子靶点。本课题利用慢病毒LV-HMGA1-RNAi分别转染两种不同的UM细胞C918和MUM-2B,构建HMGA1表达稳定下调的UM细胞模型,我们发现HMGA1对UM肿瘤细胞增殖和转移的促进作用可能是通过激活P13K/Akt/MMP-9通路而完成的。MiR-222在人类多种恶性肿瘤中均存在着表达异常;已知miR-222可通过与多个靶基因结合,搭建出一张高效且复杂的调控网络,影响肿瘤发生和转移行为。我们利用miR-222-3pmimics及miR-222-3p inhibitor分别转染C918和MUM-2B细胞,结果发现,在miR-222-3p mimics转染组中,C918和MUM-2B的细胞活性明显升高,凋亡程度降低且迁移能力增强;相反,在miR-222-3p inhibitor转染组中C918和MUM-2B的凋亡程度加重,细胞活性和迁移能力均被削弱。我们通过查询生物学网站miRTarBase进行分子靶点预测,数据库检索结果提示,miR-222与HMGA1之间存在着相互作用靶点。通过RT-PCR证实,HMGA1表达水平与miR-222 mimics呈正向调控关系,与miR-222 inhibitor呈反向调控关系。分别提取miR-222-3p mimics及miR-222-3p inhibitor转染组中UM细胞的总RNA 及总蛋白质,行 RT-PCR 和 Western blot 检测,分析 miR-222 对 PI3K/Akt/MMP-9通路信号水平的影响。结果发现,miR-222受到HMGA1基因直接调控,HMGA1通过促进miR-222表达,从而激活PI3K/Akt/MMP-9通路,发挥着对UM肿瘤细胞增殖和转移的调控作用。最后,我们在裸鼠体内进行了再次验证,发现HMGA1同样在活体内发挥着促进瘤体生长的作用,且此功能是通过PI3K/Akt/MMP-9通路参与完成的。综上所述,本课题提出,通过抑制HMGA1表达,靶向性阻断MMP-9上游的PI3K/Akt通路,从而阻止由MMP-9介导的UM细胞侵袭和迁移;HMGA1与miR-222 之间可能存在有相互的作用靶点,miR-222 可通过对 PI3K/Akt/MMP-9 通路进行活化而参与UM的进展过程。本课题通过对HMGA1在UM肿瘤中作用机制的深入研究,为UM肿瘤生物标志物和临床治疗靶点研究提供了可靠的基础数据和理论支持。