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三氧化二砷（As2O3）是传统中药砒霜中的主要成分,现代药理学和分子生物学证明了As2O3治疗肿瘤的有效性并具有广谱抗癌作用,尤其在治疗急性早幼粒细胞性白血病更是取得满意的疗效。而As2O3属剧毒药,在临床上治疗安全窗口较小,在应用中会产生较多不良反应,毒副作用大大限制了其临床应用。文献及前期研究显示:南天竹提取物对抗肿瘤药三氧化二砷具有减毒持效作用,南天竹中生物碱类成分为主要减毒活性成分,单一生物碱减毒作用均不及总生物碱部位,提示南天竹生物碱类成分对三氧化砷减毒具有明显的多靶点、多途经的中医药特点。然而,南天竹籽总生物碱部位分离纯化工艺有待优选、南天竹籽总生物碱类部位化学成分有待进一步阐明。据此,开展了南天竹籽总生物碱对As2O3减毒作用相关研究。本课题分为四个部分,具体研究内容如下:1.南天竹籽总生物碱提取纯化工艺研究本实验以小檗碱作为对照品,采用酸性染料比色,得到南天竹籽中总生物碱的最佳提取工艺条件为8倍量75%的乙醇回流提取3次,每次1 h。HPD-722型树脂具有最佳的吸附及洗脱参数,其最佳纯化条件为:上样液总生物碱质量浓度为4 mg·mL-1,上样量35 mL,上样流速2 mL·min-1,先以6 BV体积的水洗去杂质,再以10 BV体积的80%乙醇以1 mL·min-1的流速洗脱,得总生物碱含量达到70%以上。2.总生物碱部位对三氧化二砷减毒作用研究通过生化指标及组织形态学检测两个方面,研究提取纯化所得的南天竹籽总生物碱部位对三氧化二砷减毒作用。生化指标检测显示,单独给药组的CK、AST、LDH、尿素氮、MDA、ALT明显高于联合给药组和空白组,单独给药组的Na+-K+-ATP酶、SOD、CAT、肌酐消除率明显低于联合给药组和空白组。组织形态学检测显示,小鼠三氧化二砷单独用药组部分出现心脏细胞水肿情况,联合用药组心脏均显示正常;大鼠三氧化二砷单独用药组心组织及细胞未见损伤,部分出现肾小球变小,肝组织中广泛出现肝细胞水肿、点状坏死,典型肝血窦扩张,嗜酸性变性,脂肪变性等损伤,而联合用药组心和肾组织及细胞未见损伤,仅少部分肝细胞出现水肿,有少量炎性细胞浸润。结合生化指标及组织形态学检测,表明提取纯化的总生物碱部位对三氧化二砷具有较明显减毒作用。3.南天竹籽总生物碱部位的化学分离与鉴定采用柱色谱技术对南天竹籽总生物碱部分进行分离纯化,共分离鉴定得到15个化合物,其中11个生物碱类成分,4个其他类成分,包括:N-Methyl-3-phenyl-N-（2S,3R,4-trihydroxy-butyl）-acrylamide（1）、N-Methyl-3-phenyl-N-（2R,3R,4-trihydroxy-butyl）-acrylamide（2）、O-甲基南天竹碱（3）、N-去甲基南天竹碱（4）、Hydroxynantenine（5）、南天宁碱（6 nantenine）、巴马亭（7 palmatine）、O-甲基球紫堇碱（8 O-methylbulbocapnine）、海罂粟碱（9 glaucine）、去二氢海罂粟碱（10 didehydroglaucine）、5-羟基-2-吡啶羧酸甲酯（11）、Amentoflavone（12）、异落叶松脂素（13）、原儿茶醛（14）、3,4-二羟基苯乙酮（15）。其中化合物1、2为新化合物,化合物5,11,12,13,14,15为首次从该植物分离得到。4.南天竹籽总生物碱定性与南天宁碱定量分析采用Peakview（Version1.2,AB SCIEX）软件对南天竹籽质谱数据进行处理,依据相对分子量测定值与精确相对分子质量的理论值偏差小于10.0×10-6的原则,基于高分辨质谱的精确分子量信息,共鉴别25个生物碱,其中已知生物碱18个,未知化合物7个。采用薄层色谱鉴别,在同一薄层板上南天竹果实总生物碱溶液与新化合物N-Methyl-3-phenyl-N-（2,3,4-trihydroxy-butyl）-acrylamide在相同位置上,显示相同的斑点。采用高效液相色谱仪,考察南天竹籽中标志性生物碱成分——南天宁碱在总生物碱中的含量,得其含量为0.227 mg/mg。