研究背景及意义糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetic Mellitus，DM)最严重的慢性并发症之一，也是导致终末期肾病的首要原因。早期DN的病理特征主要包括系膜基质聚集和肾小球基底膜增厚，DN进展的病理学标志是肾小球结节性硬化与肾间质纤维化，而尿蛋白持续性增多是DN的临床特征，也是导致不可逆性肾衰竭的主要原因。因此，对DM的早期干预成为DN重要的防治措施。足细胞作为肾小球滤过屏障的关键结构之一，它能够有效阻止血浆蛋白的漏出。已有许多研究认为足细胞数量减少是肾脏疾病如DN进展和局灶节段性硬化的前兆，足细胞的损伤和丢失会严重破坏肾小球滤过屏障的完整性，促使肾小球发生硬化。肾小球的不断硬化将导致肾功能不可逆性丧失，最终发展至终末肾衰竭期。足细胞数量减少与其基本缺乏再生能力有关，而糖尿病等应激因素往往会导致细胞内受损的蛋白和细胞器积聚，产生细胞毒性，若不能及时清除就会诱发细胞凋亡或坏死，引起不可逆性的足细胞损伤和功能失调，进而导致足细胞缺失。因此，减少足细胞损伤和稳定足细胞数量可能是延缓DN进展的一个有效措施。自噬即细胞的自我吞噬，是细胞内一个重要的降解机制，也是真核细胞一种固有的生理功能，对维持细胞内环境和细胞生存至关重要，它能够通过细胞内的溶酶体有效清除和降解细胞内受损的细胞器和有害物质，并将降解产物送至胞浆重新利用。正常情况下足细胞具有较高的自噬活性，已有研究证明足细胞自噬缺陷是导致蛋白尿和肾小球硬化的重要触发点，因此自噬对稳定足细胞数量和减轻足细胞损伤具有重要作用。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)在自噬信号通路中占有枢纽地位。mTOR是一个重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在进化上非常保守，它对细胞自噬起着负调控作用，mTOR活化可以抑制自噬体形成，许多因素对自噬的影响都与mTOR的活性变化有关。新近研究表明，足细胞mTOR活化是DN发生和发展的关键环节，减弱足细胞mTOR活化可以显著抑制DN进展。但mTOR、足细胞自噬和DN三者之间的关系尚缺乏深入研究，作为自噬的负调控因子，mTOR活化将不可避免的导致足细胞自噬减弱。我们推测，DN的发生和发展可能与mTOR活化后自噬减弱导致的足细胞损伤和缺失有关，而抑制足细胞mTOR活化，维持自噬平衡可能是DN的重要治疗靶点。雷帕霉素(Rapamycin，Rapa)是由美国食品和药物管理局批准在临床上用于器官移植后抑制排斥反应的药物，它能特异的与mTOR激酶结合，抑制mTOR活性，从而诱导自噬。本研究课题首先明确由链尿佐菌素(Streptozotocin，STZ)制备的Ⅰ型糖尿病(Diabetic mellitus,DM)小鼠足细胞自噬与DN的关系，然后观察雷帕霉素对DM小鼠足细胞自噬水平、mTOR活性和DN的影响。我们的研究结果表明，雷帕霉素腹腔注射可减少DM小鼠尿白蛋白的排泄，减轻足细胞损伤，从而延缓小鼠DN进展，并且雷帕霉素的上述作用可能与促进足细胞自噬、抑制足细胞凋亡有关。研究方法1、健康雄性Balb/c小鼠36只，采用完全随机设计分组法分为三组：正常对照组(Control组，n=12)、糖尿病组(DM组，n=12)和雷帕霉素处理组(DM+Rapa组，n=12)。采用腹腔注射STZ诱导DM小鼠模型，待DM模型成功后即予以腹腔注射雷帕霉素，注射剂量为2mg/kg/48h。2、雷帕霉素注射0、2、4、8、12周后分别称取各组小鼠体质量，并采用尾静脉针刺取血的方法检测血糖。12周留取24h尿标本，测定小鼠尿白蛋白(Urinary albumin，UA)和肌酐，计算尿蛋白/肌酐值(Urinary albumin creatinine，UACR)；心脏取血检测血肌酐(Serum creatinine，Scr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)，并在12周后取肾脏称重，计算肾质量/体质量比(Kidney weight/Body weight，KW/BW)。3、雷帕霉素注射12周后各组小鼠的肾脏组织行PAS染色观察肾脏病理改变，透射电镜和免疫荧光染色分别观察足细胞内自噬体大小、数量和足细胞损伤情况。Western blot检测足细胞自噬标志蛋白LC3(Microtubules associated protein1light chain3，LC3)、p-mTOR、p-p70S6K(mTOR通路下游靶蛋白)、凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达变化。免疫荧光、Western blot和免疫组织化学染色分别检测足细胞标志物Nephrin、Podocin和WT-1蛋白表达的变化，以此观察肾小球足细胞的数量。实验结果1、与对照组相比，DM组小鼠血糖、UACR、肾质量/体质量明显升高；雷帕霉素处理后，DM小鼠尿蛋白的排出减少，肾质量/体质量值降低，而血糖无明显变化。2、PAS染色结果发现DM组小鼠肾小球基底膜增厚，系膜基质增多，WT-1免疫组织化学染色发现DM组小鼠肾小球内足细胞数量明显减少；雷帕霉素腹腔注射12周后，DM小鼠肾小球系膜基质明显减少，足细胞损伤减轻而数量增多，肾小球病理变化得到改善。3、透射电镜结果提示，DM组小鼠肾小球基底膜增厚，足细胞足突增宽融合，足细胞内自噬体数量减少；雷帕霉素腹腔注射12周后，DM小鼠足细胞损伤减轻，自噬体的数量明显增多。4、Western Blot结果表明，DM组小鼠足细胞自噬体活化的分子标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值下降，p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达明显增多，免疫荧光染色发现DM组小鼠足细胞内LC3蛋白表达明显下调，腹腔注射雷帕霉素12周后，DM小鼠肾小球足细胞内的LC3蛋白表达明显上调，p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达明显下调，说明雷帕霉素可以通过抑制过度激活的mTOR信号通路而提高足细胞自噬水平。5、Western Blot结果发现，DM组小鼠足细胞标志蛋白Nephrin和Podocin表达明显减少，凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达明显增多，免疫荧光染色也发现足细胞Nephrin蛋白表达下降，免疫组织化学染色结果显示WT-1阳性足细胞数量减少，而雷帕霉素腹腔注射12周，DM小鼠足细胞标志物Nephrin、Podocin和WT-1的蛋白表达明显增加，凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达则显著降低，这提示雷帕霉素治疗可以维持DM小鼠足细胞数量，抑制足细胞凋亡。实验结论1、DM小鼠出现明显的足细胞损伤和足细胞数量减少，足细胞自噬水平降低。2、雷帕霉素腹腔注射可明显减少DM小鼠尿蛋白的排泄，减轻足细胞损伤，延缓DN进展，其作用并不是通过影响血糖水平而实现的。3、雷帕霉素改善DN的作用可能与促进足细胞自噬活性和抑制足细胞凋亡有关。