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目的:白血病是人体血液系统的恶性肿瘤性疾病。可根据病情急缓和细胞的成熟程度将白血病分类为急性和慢性两类。急性白血病由于其发作急、快速进展,临床尚未有特效的治疗药物。因此,对急性白血病致病机制的研究,引起了学者们的广泛关注。急性白血病患者的骨髓中,异常的原始细胞及幼稚细胞在各种致癌因子的作用下,无限增殖,取代了原有的正常造血细胞,抑制人体的正常造血,并浸润淋巴结、肝、脾、睾丸和中枢神经系统(包括大脑和脊髓),表现为贫血(疲劳)、血小板减少(出血)、和中性粒细胞减少(频繁感染)。急性白血病可根据细胞类型进一步分类为急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病(AML)两类。AML是成年人中最常见的白血病类型之一,且通常老年患者发病居多。45岁前AML的发病率较低,随着年龄增长,发病率越高,预后越差。据报道,首次诊断为AML的患者平均年龄为68岁。以AML为代表的白血病的治疗,目前仍是临床面临的难题。众所周知,涉及11q23染色体上混合谱系白血病(MLL)基因重排的白血病,是最具侵袭性及药物抵抗性的白血病,具有恶性程度高,化疗效果差,且预后不良的特点。世界卫生组织于2011年发布白血病分类修订时将11q23/MLL基因重排白血病单独列为一类。MLL基因重排在AML中十分常见,目前已发现超过60种不同融合基因及100种的重排形式,其中最常见的是MLL融合基因AF9,在所有AML患者中占2%~5%。据文献报道,在AML干细胞中,经典NF-κB信号通路被激活,以维持的白血病干细胞(LSC)的干性。本课题组在之前的研究中发现,激活非经典NF-κB诱导激酶(NIK)的表达可抑制MLL-AF9诱导的AML进展,提示非经典NF-κB信号通路与经典NF-κB信号通路在AML进展中具有相反的作用。然而,非经典NF-κB通路在AML中的具体作用机制及其下游靶点仍有待进一步探究,以阐明AML的发病机制及挖掘潜在的AML治疗靶点。在之前的研究中,我们发现激活NIK的表达后,AML细胞中具有叉头相关结构域B的TRAF相互作用蛋白(TIFAB)的表达显著下调。据报道,TIFAB在髓系恶性肿瘤中与5q染色体的缺失有关;TIFAB可显著影响造血干/祖细胞的比例及骨髓分化。因此,我们在本研究中聚焦于TIFAB在MLL-AF9诱导的AML中的作用,旨在进一步探索非经典NF-κB通路在AML中发挥作用的具体机制及TIFAB如何通过HOXA9影响MLL-AF9诱导的AML的进展。研究方法:1、细胞系研究模型:MLL-AF9诱导的AML细胞、人肾上皮细胞293T。2、实验动物研究模型:NIKERT2和NIKfl STOPRel Bfl/flERT2基因突变小鼠、CD45.1受体小鼠。3、分子生物学实验:应用q PCR和免疫印迹实验检测分子表达情况;CHIP-q PCR用于判断细胞内DNA与蛋白质的相互作用;应用细胞计数、Brd U、Ki67、集落形成实验检测细胞增殖能力;应用Caspase3染色实验检测细胞凋亡能力;应用Mito-tracker染色实验检测细胞线粒体质量;应用Mito Sox染色实验检测细胞线粒体活性氧水平;应用2-NBDG染色实验检测细胞葡萄糖吸收水平;小鼠AML细胞移植实验用于表型的验证。4、生物信息学分析:相关数据由GEO(Gene Expression Omnibus)、GEPIA2(Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2)、TCGA(The Cancer Genome Atlas)等平台获取;基因富集分析(GSEA)被用于分析RNA-seq数据以预测基因的相关功能。5、统计学分析:通过独立样本t检验判断不同分组的变量之间是否存在差异。应用Kaplan-Meier曲线描绘小鼠和患者生存状态,并进行Log-rank检验比较不同分组之间的生存状态差异。应用Graph Pad Prism 7、R 3.6等软件完成上述相关分析。将P值小于0.05界定为差异存在统计学意义的标准。结果:1、NIK通过激活RELB抑制MLL-AF9诱导的AML进展。RELB直接调控TIFAB且RELB抑制TIFAB的表达。小鼠AML移植实验结果显示,激活NIK表达可延长AML小鼠的生存期,而敲除RELB可逆转NIK对AML的抑制作用。前期研究的RNA-seq(GSE97389)数据分析显示,激活MLL-AF9诱导的AML细胞的NIK表达可抑制TIFAB在m RNA水平上的表达,并通过q PCR实验得到了验证。免疫印迹实验结果表明,在MLL-AF9诱导的AML细胞中激活NIK上调RELB的表达,同时下调RELA的表达;激活NIK抑制TIFAB的表达,敲除RELB可逆转NIK对TIFAB的抑制作用。CHIP-q PCR结果显示,RELB直接调控TIFAB。免疫印迹实验结果显示,在MLL-AF9诱导的AML细胞中过表达RELB抑制TIFAB的表达,而过表达RELA没有这样的效果。2、TIFAB促进MLL-AF9诱导的AML的进展。GEPIA2数据库检测结果表明,TIFAB m RNA的表达水平在AML患者肿瘤细胞中的表达高于正常对照。TCGA数据库分析结果表明,TIFAB表达高的AML患者预后较差。在MLL-AF9诱导的AML细胞中过表达TIFAB。细胞计数实验、Brd U和Ki67染色实验结果显示,TIFAB促进c-Kit+AML细胞增殖。Caspase3染色实验表明,TIFAB抑制c-Kit+AML细胞凋亡。小鼠AML细胞移植实验显示,过表达TIFAB显著缩短AML小鼠的生存期。通过流式细胞术分选出过表达TIFAB的LSC及其对照组,而后对其进行RNA-seq测序(GSE178853),结果表明,TIFAB上调HOXA家族等参与维持LSC特性基因的表达。对RNA-seq数据进行GSEA分析,结果表明TIFAB影响LSC髓样分化、干性特征及细胞能量代谢。Mito-tracker染色结果表明,TIFAB促进AML细胞线粒体质量增加。Mito Sox染色实验表明,TIFAB促进AML细胞线粒体活性氧增加。2-NBDG染色实验结果表明,TIFAB促进AML细胞对葡萄糖的吸收。免疫印迹实验结果显示,TIFAB上调AML细胞呼吸链复合物UQCRC2和MTCO1蛋白的表达。3、TIFAB通过上调HOXA9加速MLL-AF9诱导的AML的进展。免疫印迹实验显示,TIFAB抑制RELB和RELA蛋白的表达。q PCR实验结果显示,过表达TIFAB的MLL-AF9诱导的AML细胞HOXA2、HOXA3、HOXA5、HOXA9和HOXA10在m RNA表达水平上增加。免疫印迹实验表明,TIFAB上调HOXA9蛋白的表达。小鼠AML细胞移植实验和细胞集落形成实验表明,NIK可以显著延长AML小鼠的生存期且抑制AML细胞集落形成,而TIFAB和HOXA9均可逆转NIK对AML的抑制作用。免疫印迹实验结果显示,激活NIK表达的AML细胞RELB蛋白表达上调,RELA和TIFAB蛋白的表达下调;过表达HOXA9可逆转NIK促进的RELB蛋白的表达;过表达HOXA9可恢复NIK抑制的RELA和TIFAB蛋白的表达。结论:1、NIK通过RELB抑制MLL-AF9诱导的AML的进展。2、TIFAB是RELB的直接靶点,且RELB抑制TIFAB的表达。3、TIFAB促进MLL-AF9诱导的AML的进展。4、TIFAB通过HOXA9加速MLL-AF9诱导的AML的进展。