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研究背景：在世界范围内，恶性肿瘤高居死亡原因的首位。我国情况亦类似，据流行病学调查表明，中国每年癌症发病人数约312万，死亡人数约270万，近20年肿瘤的发病率和死亡率均呈逐渐上升趋势，成为城市和农村居民的第一位死因。肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌是最常见的5种肿瘤杀手，严重威胁着人类健康。在肿瘤治疗方面，常规的细胞毒性抗癌药物的特异性低、毒副作用大，而靶向抗肿瘤药物可针对肿瘤的发病机制抑制肿瘤的发生、发展，毒副作用小。因此寻找一个有效的靶向药物成为肿瘤研究的一项新课题。Hedgehog (Hh)信号通路在胚胎的正常发育过程中发挥关键性作用，而随着个体的发育成熟，Hh信号通路逐渐失活。近年研究表明Hh信号通路的异常激活与肿瘤的发生、发展有着密切联系。为了研究Hh信号通路异常激活的分子机制，我们采用酵母双杂交的方法，以Hh信号通路负调控因子SuFu为诱饵蛋白，与文库杂交，发现SuFu与二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）相互作用。DHFR可以将体内的二氢叶酸（FH2）还原为四氢叶酸（FH4），从而调节四氢叶酸的再生。DHFR的敲除和过表达影响肿瘤细胞的增殖和凋亡。因此，研究DHFR在Hh信号通路中的作用对于深入了解肿瘤的发生、发展有着重要意义。研究目的：1、通过酵母双杂交与生化学方法研究DHFR与Hh信号通路的负性调控因子SuFu之间的相互作用关系。2、研究DHFR对Hh信号通路关键因子SuFu、Gli1、Gli2和细胞周期调控蛋白Cyclin D1的影响，以及对肿瘤细胞凋亡的影响，探讨DHFR在肿瘤发生、发展中的作用和意义。研究方法：一、质粒的构建1、设计不同的DHFR引物，采用基因克隆的方法分别构建pGADT7-DHFR、DHFR-pcDNA3.1/myc-his、pEGFP-DHFR、pcDNA3-FLAG-DHFR四种表达质粒。2、设计并构建DHFR的干扰质粒，检测干扰质粒的干扰效果。二、研究DHFR与SuFu之间的相互作用关系采用酵母双杂交和GST pull-down法检测DHFR和SuFu之间是否存在相互作用。三、研究DHFR对Hh信号通路的影响1、蛋白质免疫印迹法检测GnRH神经细胞系NLT和人脑胶质瘤细胞系U87、U251、H4中DHFR、SuFu、Gli、Cyclin D1的蛋白质水平以及DHFR抑制剂甲氨蝶呤（MTX）处理细胞前后和过表达DHFR或miRNAi敲低DHFR后的相关蛋白质水平；2、qRT-PCR法检测MTX处理细胞前后及过表达DHFR或miRNAi敲低DHFR后Hh信号通路相关因子的mRNA水平；3、利用Gli-luciferase表达质粒的稳定转染细胞系，用不同浓度MTX处理细胞，观察对Gli转录活性的影响；4、MTT法检测不同浓度MTX处理细胞后的细胞存活率。研究结果：1、成功构建了DHFR的表达质粒和干扰质粒；2、酵母双杂交实验中，QDO/X/A平板上酵母能够生长且菌落呈蓝色，而对照组不能生长，证实了SuFu蛋白和DHFR蛋白存在相互作用； GST pull-down实验中， SuFu蛋白能与DHFR蛋白相结合，而GST蛋白不能，表明了DHFR与SuFu在体外能够相互作用；3、相比GnRH神经细胞系NLT，人脑胶质瘤细胞系U87、U251、H4的DHFR、Gli1、Gli2蛋白表达较高，提示在人脑胶质瘤细胞中，DHFR呈高表达，Hh信号通路活性增加；4、(1) miRNAi敲低DHFR后Gli1、Gli2的mRNA水平和蛋白水平降低，而SuFu升高；(2) MTX抑制DHFR后Gli1、Gli2的mRNA水平和蛋白水平降低，而SuFu和DHFR不变；(3)过表达DHFR后Gli1的mRNA水平和蛋白水平升高，而SuFu降低；提示DHFR正调控Hh信号通路活性；5、用MTX处理稳定表达Luciferase-8GBS的293T细胞，荧光素酶活性报告实验结果表明，随着MTX浓度的增加，Gli转录活性逐渐下降，提示DHFR正调控Hh信号通路活性；6、用MTX分别处理H4细胞24h和48h，酶标仪检测各组别的吸光度值，结果显示24h组和48h组的细胞生长抑制率随着MTX浓度的增加呈逐渐上升趋势，提示DHFR正调控Hh信号通路活性。研究结论：1、DHFR与SuFu相互作用；2、DHFR通过结合Hedgehog信号通路的关键调控因子SuFu正调控Hh信号通路。