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犬瘟热(canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)感染引起的一种急性、热性、高度接触传染性疾病;是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的动物传染病之一。
本研究根据CDV弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计套式PCR引物,建立RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该方法可特异扩增出CDV NP基因片段,但其它RNA病毒狂犬病病毒(RV)、DNA病毒犬细小病毒(CPV)以及正常Vero细胞中均未扩增出目的基因。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-3 稀释度的病毒RNA,而本研究建立的RT-nested PCR可以扩增10-6 稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR对石河子地区疑似感染CDV病料的检测结果表明,本研究建立的检测方法,可以有效的检测CDV感染,适用于动物CDV的快速诊断和流行病学调查。
本研究将患病犬组织研磨上清接vero细胞,盲传5代后出现细胞病变,RT-nestedPCR方法检测收获的冻存细胞裂解上清。细胞病变为细胞拉伸拉长,出现空泡,有的局部细胞明显收缩脱落。PCR产物电泳出现特异性目的条带,测序结果显示为CDV的特异性核酸序列。与病料中的测序结果进行比对,同源性为100%,说明病料接入细胞后,未产生核酸的突变。初步获得犬瘟热病毒石河子株细胞接毒物。
本研究根据GenBank上公布的CDV核衣壳蛋白和血凝蛋白基因序列,设计引物,扩增出CDV石河子株的核衣壳蛋白和血凝蛋白基因序列,进行序列比对分析。结果表明,扩增核衣壳蛋白基因为1688bp,完整的开放阅读框(ORF)为1572bp,编码 523aa,与XJ-5(HM596313)的氨基酸同源性为(100%),但核苷酸的差异为不同位置的2个碱基。扩增血凝蛋白基因为607bp,编码202aa;与TN株(AY390347)氨基酸同源性为98.02%,与日本KDK-1株(AB025271)氨基酸同源性96.05%。序列分析结果认为,CDV石河子株属于亚洲Ⅰ型。
本研究预测CDV石河子株NP基因ORF编码蛋白二级结构,分析其抗原表位,设计双酶切引物,构建原核表达载体并进行表达。结果表明,核衣壳蛋白存在明显的抗原表位,成功构建表达载体。优化条件,SDS-PAGE分析结果显示,1mmol/L IPTG诱导8h,可获得最佳表达,分子量为24.9KDa,与预计蛋白分子量一致。为下一步的目的蛋白纯化、NP免疫特性、结构与功能奠定基础。
总之,本研究从分离犬瘟热病毒入手,分析CDV石河子株核衣壳蛋白和血凝蛋白基因系统进化关系,成功构建原核表达载体并获得表达,得到目的蛋白,为研究CDV核衣壳蛋白的免疫原性、结构和功能关系的奠定基础。