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背景
三果汤(Triphala)为藏医重要的方剂，由诃子TerminaliachebulaRetz(TC)、余干子PhyllanthusemblicaLinn(PE)、毛诃子Terminaliabellerica(Gaertn)Roxb(TB)三味药材构成，藏医理论主治“赤巴”、“白脉”等症。现代研究表明，Triphala主要含有柯里拉京(Corilagin，CL)、鞣花酸等酚酸类，具有很强的抗氧化和神经保护作用。睡眠障碍已逐渐成为威胁人类健康的突出问题，且多数患者并没有得到合理的诊治。现研究睡眠不足的传统方法是通过感官刺激进行剥夺睡眠(Sleep deprivation， SD)。国内外研究已经证实氧化应激是SD诱发机体损伤的关键机制之一。而海马损伤是导致认知功能障碍发生的关键因素。SD导致机体内在的氧化与抗氧化机制失衡，机体氧化应激增强，且自身的抗氧化应激机制也即时启动。而中枢神经系统的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)主要是来源于NADPH(NOX2)氧化酶。内源性抗氧化通路核转录NF-E2相关因子(Nuclear factor erythroid2-related factor 2， Nrf2)/抗氧化反应元件(Antioxidant response elements，ARE)通路可抵消外界刺激引起的氧化应激反应，保护机体免受损伤，是机体重要的抗氧化信号通路。因此，SD所致认知功能障碍的治疗主要集中在恢复这种平衡，一方面抑制机体的氧化应激，另一方面加强机体自身的抗氧化能力。但是Triphala改善SD后认知障碍的作用及药效组分作用机制均不清楚，有待揭示，限制了其应用开发。故本研究基于多组分Triphala在藏医理论的应用及SD诱导认知功能的损伤机制，对Triphala改善SD诱导认知障碍进行研究，为睡眠障碍的机制研究及对证中药Triphala的二次开发提供理论依据。
目的
1.基于网络药理学方法探讨Triphala的成分-靶点网络，明确其心脑保护的作用机制；
2.研究Triphala对SD所致认知功能障碍的改善作用及药效组分，探讨其作用和机制；
3.以组分CL和Nrf2为切入点，确证并反馈验证组分CL调控Nrf2/NOX2平衡对SD后小鼠认知功能障碍的改善作用机制。
方法
1.研究采用中药系统药理学技术平台中的药动学参数(口服利用度和药物相似性)筛选Triphala的潜在活性成分，并预测和筛选其成分的靶点，利用Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点”网络。通过AlzData数据库分析靶标在不同细胞的表达情况，利用DAVID数据库对Triphala中各成分作用靶点进行生物学过程(Biological process， BP)富集分析。
2.通过改良多平台水环境法(Modified multiple platform method, MMPM)造SD模型。将C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、睡眠剥夺组(SD)、三果汤组(Triphala)，每组8只，适应性饲养一周后，连续灌胃给药22天，期间利用MMPM对小鼠进行SD连续72h，应用行为学实验包括水迷宫(Morris water maze, MWM)和新物体识别(Novel object recognition, NOR)等检测小鼠的认知功能，并于第22天给药结束后处死。并进一步检测Triphala对转录因子Nrf2及NOX2蛋白的影响，探讨Triphala改善SD诱导的认知功能障碍的作用机制。应用分子对接软件筛选出Triphala对SD诱导的认知功能障碍的改善的活性成分。
3.采用MWM和NOR等行为学实验验证Triphala组分CL对SD小鼠认知功能障碍的改善作用，采用Westernblot方法和谷氨酸(Glutamate，Glu)诱导海马神经元细胞氧化损伤模型探讨CL对神经元细胞的保护作用机制。
结果
1.得到23个药效组分、65个关键靶点，且靶标主要集中表达在脑神经元细胞中，此外也在星形胶质细胞、内皮细胞和小胶质细胞中表达。生物学过程的富集分析显示Triphala主要影响神经元的氧化应激等生物学过程。
2.新物体识别和水迷宫探索行为学实验结果显示Triphala对SD诱导的认知功能障碍小鼠具有很好的改善作用。Triphala干预可使得SD小鼠提高脑中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutases, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)抗氧化防御酶活性，使丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量趋于正常。Triphala可以激活Nrf2/HO-1信号通路且抑制NOX2蛋白表达。分子对接结果显示Triphala组分CL与Nrf2蛋白相结合能力最好，提示CL可能是Triphala发挥作用主要组分之一。
3.行为学实验结果表明CL对SD所诱导的认知功能障碍小鼠具有很好的改善作用。CL可以通过激活Nrf2/HO-1与抑制NOX2表达，进而调控Nrf2/NOX2平衡，减轻氧化应激改善SD诱导的认知功能障碍。CL可以保护海马神经元细胞免受Glu诱导的细胞凋亡，并减少海马神经元细胞中ROS水平。在NOX2转染的神经元中增强了CL的保护作用，在Nrf2转染的神经元中抑制了CL的保护作用。
结论
Triphala中多酚类等组分通过多靶点发挥心脑保护作用，氧化应激是其潜在的生物学机制之一。Triphala及组分CL通过调控Nrf2/NOX2平衡，进而减轻氧化应激改善睡眠剥后认知功能障碍，通过本课题的研究，为睡眠障碍的机制研究及对证中药Triphala的二次开发提供理论依据。
三果汤(Triphala)为藏医重要的方剂，由诃子TerminaliachebulaRetz(TC)、余干子PhyllanthusemblicaLinn(PE)、毛诃子Terminaliabellerica(Gaertn)Roxb(TB)三味药材构成，藏医理论主治“赤巴”、“白脉”等症。现代研究表明，Triphala主要含有柯里拉京(Corilagin，CL)、鞣花酸等酚酸类，具有很强的抗氧化和神经保护作用。睡眠障碍已逐渐成为威胁人类健康的突出问题，且多数患者并没有得到合理的诊治。现研究睡眠不足的传统方法是通过感官刺激进行剥夺睡眠(Sleep deprivation， SD)。国内外研究已经证实氧化应激是SD诱发机体损伤的关键机制之一。而海马损伤是导致认知功能障碍发生的关键因素。SD导致机体内在的氧化与抗氧化机制失衡，机体氧化应激增强，且自身的抗氧化应激机制也即时启动。而中枢神经系统的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)主要是来源于NADPH(NOX2)氧化酶。内源性抗氧化通路核转录NF-E2相关因子(Nuclear factor erythroid2-related factor 2， Nrf2)/抗氧化反应元件(Antioxidant response elements，ARE)通路可抵消外界刺激引起的氧化应激反应，保护机体免受损伤，是机体重要的抗氧化信号通路。因此，SD所致认知功能障碍的治疗主要集中在恢复这种平衡，一方面抑制机体的氧化应激，另一方面加强机体自身的抗氧化能力。但是Triphala改善SD后认知障碍的作用及药效组分作用机制均不清楚，有待揭示，限制了其应用开发。故本研究基于多组分Triphala在藏医理论的应用及SD诱导认知功能的损伤机制，对Triphala改善SD诱导认知障碍进行研究，为睡眠障碍的机制研究及对证中药Triphala的二次开发提供理论依据。
目的
1.基于网络药理学方法探讨Triphala的成分-靶点网络，明确其心脑保护的作用机制；
2.研究Triphala对SD所致认知功能障碍的改善作用及药效组分，探讨其作用和机制；
3.以组分CL和Nrf2为切入点，确证并反馈验证组分CL调控Nrf2/NOX2平衡对SD后小鼠认知功能障碍的改善作用机制。
方法
1.研究采用中药系统药理学技术平台中的药动学参数(口服利用度和药物相似性)筛选Triphala的潜在活性成分，并预测和筛选其成分的靶点，利用Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点”网络。通过AlzData数据库分析靶标在不同细胞的表达情况，利用DAVID数据库对Triphala中各成分作用靶点进行生物学过程(Biological process， BP)富集分析。
2.通过改良多平台水环境法(Modified multiple platform method, MMPM)造SD模型。将C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、睡眠剥夺组(SD)、三果汤组(Triphala)，每组8只，适应性饲养一周后，连续灌胃给药22天，期间利用MMPM对小鼠进行SD连续72h，应用行为学实验包括水迷宫(Morris water maze, MWM)和新物体识别(Novel object recognition, NOR)等检测小鼠的认知功能，并于第22天给药结束后处死。并进一步检测Triphala对转录因子Nrf2及NOX2蛋白的影响，探讨Triphala改善SD诱导的认知功能障碍的作用机制。应用分子对接软件筛选出Triphala对SD诱导的认知功能障碍的改善的活性成分。
3.采用MWM和NOR等行为学实验验证Triphala组分CL对SD小鼠认知功能障碍的改善作用，采用Westernblot方法和谷氨酸(Glutamate，Glu)诱导海马神经元细胞氧化损伤模型探讨CL对神经元细胞的保护作用机制。
结果
1.得到23个药效组分、65个关键靶点，且靶标主要集中表达在脑神经元细胞中，此外也在星形胶质细胞、内皮细胞和小胶质细胞中表达。生物学过程的富集分析显示Triphala主要影响神经元的氧化应激等生物学过程。
2.新物体识别和水迷宫探索行为学实验结果显示Triphala对SD诱导的认知功能障碍小鼠具有很好的改善作用。Triphala干预可使得SD小鼠提高脑中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutases, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)抗氧化防御酶活性，使丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量趋于正常。Triphala可以激活Nrf2/HO-1信号通路且抑制NOX2蛋白表达。分子对接结果显示Triphala组分CL与Nrf2蛋白相结合能力最好，提示CL可能是Triphala发挥作用主要组分之一。
3.行为学实验结果表明CL对SD所诱导的认知功能障碍小鼠具有很好的改善作用。CL可以通过激活Nrf2/HO-1与抑制NOX2表达，进而调控Nrf2/NOX2平衡，减轻氧化应激改善SD诱导的认知功能障碍。CL可以保护海马神经元细胞免受Glu诱导的细胞凋亡，并减少海马神经元细胞中ROS水平。在NOX2转染的神经元中增强了CL的保护作用，在Nrf2转染的神经元中抑制了CL的保护作用。
结论
Triphala中多酚类等组分通过多靶点发挥心脑保护作用，氧化应激是其潜在的生物学机制之一。Triphala及组分CL通过调控Nrf2/NOX2平衡，进而减轻氧化应激改善睡眠剥后认知功能障碍，通过本课题的研究，为睡眠障碍的机制研究及对证中药Triphala的二次开发提供理论依据。