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黑斑病是三七[Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen]种植生产过程中危害最为严重的病害之一,该病病原菌人参链格孢(Altemaria panax Whetzel)寄主范围广泛且生存能力强,黑斑病发病快、传播迅速,三七产量常因该病损失达10%以上。目前有关黑斑病的研究主要集中在黑斑病病原菌的生物学特性、三七黑斑病发生规律和黑斑病的综合防治上,而对于人参链格孢侵染过程中三七-病原菌互作的分子生物学研究还没有报道。本研究利用高通量测序技术,对病原菌侵染三七后不同时间点的三七叶片进行转录组分析,发现一个高表达的几丁质酶基因,并对它进行了克隆和表达特性分析。主要结果如下:1、人工接种黑斑病的方法:石英砂处理三七叶片后接种人参链格孢菌丝体,并且保持较高的湿度。该方法能快速有效的使植株发病,病症明显。用试剂盒提取三七根、叶总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测发现28S、18S和5.8S三条带清晰可见,28S条带亮度约是18S的2倍;紫外分光光度计检测A260/280的比值在1.8～2.0之间,A260/230的比值略低,在0.6～1.5之间,RNA浓度在400～800ng/L之间。2、采用Illumina Hi-Seq 4000测序平台,对感染黑斑病不同时间点的三七叶片进行转录组测序。共获得37.65 Gb的数据。组装并去冗余后得到114,009个Unigene,总长度,平均长度,N50 以及GC含量分别为 135,607,883 bp,1,189 bp,1,947 bp 和 40.34%。然后将All-unigene通过BLAST比对到七大功能数据库进行注释,最终分别有73,870(NR:64.79%)、70,520(NT:61.85%)、52,477(Swissprot:46.03%)、31,240(COG:27.40%)、47,135(KEGG:41.34%)、33,569(GO:29.44%)以及 53,630(Interpro:47.04%)个Unigene获得功能注释。根据注释结果共检测出72,553个CDS,未注释上的Unigene使用ESTScan预测后获得4,231个CDS。同时还检测20,927个SSR分布于16,406个Unigene中;从7个转录本中共检测出444,745个SNP位点。各组间交集差异基因共有464个,包含蛋白激酶类、细胞色素P450家族、WRKY转录因子等。3、本实验基于三七中编码几丁质酶的基因Unigene19153_All设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到一个新的几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为PnCHI1。PnCHI1的cDNA全长为1 022 bp,含有822 bp的开放阅读框,26 bp 5’-非翻译区以及174bp的3’-非翻译区,编码具有273个氨基酸的蛋白质。该基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族成员,进化树分析表明PnCHI1编码的氨基酸序列属于Ⅳ类几丁质酶。qRT-PCR分析结果显示,植物信号分子水杨酸、茉莉酸甲酯、H2O2和乙烯处理可均明显诱导三七根中乃PnCHI1的转录水平;三七叶片接种人参链格孢后,PnCHI1的表达量迅速升高,呈波动上升趋势。上述结果表明PnnCHI1参与三七对黑斑病菌的防卫反应。