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血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1 ,HO-1)是体内唯一可被诱导的血红素加氧酶,能够降解血红素为等摩尔一氧化碳、胆绿素和铁离子。在多种细胞中,它均能受到很多因素诱导而高表达,例如:血红素、炎症细胞素、加热、重金属、激素、紫外线、缺氧和一氧化氮等,被诱导的HO-1发挥抗炎及调节凋亡的作用。研究表明,HO-1与很多疾病相关,如:肿瘤、肠炎、脓毒血症、氧惊厥、神经元退行性病变、缺血性脑损伤、动脉粥样硬化、哮喘、高血压等。在体内,表达的HO-1抑制内毒素性休克、(组织内)氧过多、急性胸膜炎以及器官移植和缺血-再灌注损伤中的炎症应答,从而在这些条件下,提供有益的帮助。许多证据表明,在很多疾病模型中,HO-1及其产物胆红素/胆绿素能利用其抗炎、抗凋亡、抗增殖及抗氧化特性,来调节其保护作用。HO-1在许多疾病中活性都有提高,因此,对于HO-1在相关疾病中的作用,以及研究HO-1活性变化在相关疾病的诊断、治疗的作用方面,都需要对相关疾病中HO-1活性进行抑制。而中和抗体能中和抗原的活性,即抑制抗原活性。因此,我们需要得到HO-1的中和抗体并筛选出其抗原表位。我们表达及纯化HO-1,制备其中和抗体,筛选抗原表位,为以后的相关研究、临床诊断、治疗及预后奠定了一定的基础。确定人血红素加氧酶-1(hHO-1)和重组大鼠血红素加氧酶-1(ΔrHO-1)在大肠杆菌中表达条件与纯化方法,并且利用纯化好的蛋白制备中和抗体,利用噬菌体肽展示库筛选出其抗原表位,并制备其多克隆抗体,利用制备好的表位多抗对其进行验证。首先酶切鉴定原核表达质粒pMW172/hHO-1及pMW172/ΔrHO-1,并对其进行测序,鉴定正确后,转入大肠杆菌BL21,通过改变摇床转速及IPTG浓度确定可溶性HO-1的最佳表达条件。为了避免HO-1的酶活性损失,尽量简化纯化步骤,利用超声波及高速离心去除大量菌体蛋白,又用分级盐析最大限度地保留了HO-1,除去了杂蛋白,S-200柱层析进一步通过分子量差异将杂蛋白分离,通过体外HO-1活性测定方法检测得到HO-1蛋白的活性。之后,利用纯化的HO-1蛋白作为抗原免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,利用ELISA方法测定其效价,以及Western-Blot技术检测抗体的特异性,并用HO-1活性测定方法测定抗体的中和活性。利用噬菌体肽展示库技术对HO-1中和型多抗进行筛选,得到HO-1抗原表位,测序后,经序列比对分析,合成可能具有中和活性的抗原表位肽段,免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体。进而,通过HO-1体外活性测定方法测定抗体的中和活性,验证其是否具有中和活性的抗原表位。本课题的实验结果:①原核表达质粒pMW172/hHO-1经测序后,HO-1基因长度为938bp,测序正确。将其转入大肠杆菌BL21后成功表达了可溶性的活性hHO-1。②超声破碎菌体,hHO-1上清经30%-40%盐析纯化及分子筛层析纯化,获得活性hHO-1蛋白,收得率为30.3%,纯化倍数为2.83倍,纯度为90%。③利用纯化后的hHO-1制备出抗hHO-1兔血清,经ELISA测定效价达到106,Western-Blot显示抗体特异性识别hHO-1。对抗体进行中和活性的测定,证实抗体能中和掉46% hHO-1的催化活性。④原核表达质粒pMW172/ΔrHO-1经测序后,HO-1基因长度为792bp,测序正确。将其转入大肠杆菌BL21后成功表达了可溶性的活性ΔrHO-1。⑤超声破碎菌体,ΔrHO-1上清经35%-55%盐析纯化及分子筛层析纯化,获得活性ΔrHO-1蛋白,收得率为34.5%,纯化倍数为1.61倍,纯度为95%。⑥利用纯化后的ΔrHO-1制备出抗ΔrHO-1兔血清,经ELISA测定效价超过1.3×107,Western-Blot显示抗体特异性识别ΔrHO-1。对抗体进行中和活性的测定,证实抗体能中和掉72.6%ΔrHO-1的催化活性。⑦同时,对抗ΔrHO-1多克隆抗体进行了与hHO-1交叉反应性的检测,ELISA及Western-Blot均证实抗ΔrHO-1多抗可以用于hHO-1的检测。即,HO-1功能区是相同的。⑧利用噬菌体肽展示库技术对纯化后抗ΔrHO-1 IgG进行表位筛选,得到12条肽段。⑨对筛选到的12条肽段测序后,得到了四个肽段组:A1组、A13组、A3组以及A7组,经序列比对分析及克隆数目的多少,初步判断A1和A13肽段最可能是中和表位,对A1、A1的天然肽及A13进行合成,制备出肽段多抗。⑩通过验证证实,抗A13的抗体可以中和掉38.7%的ΔrHO-1催化活性,具有中和HO-1活性的功能,为中和表位,A1和天然肽为结合表位。由以上结果得出如下结论:通过表位筛选及验证,得到了A1、天然肽及A13 3条肽段,其中,A1及其天然肽HO-1的结合表位,A13的抗体具有中和HO-1催化活性的特性,为具有中和HO-1活性的抗原表位。若合成其的小分子单链抗体,则可以应用到相关疾病的研究中,为以后临床诊断、治疗及预后奠定了一定的基础。