目的:本实验以穿龙薯蓣种子为主要研究对象,通过对初生、次生代谢产物及代谢过程中关键酶基因表达量的动态分析研究,探讨环境因子对穿龙薯蓣种子萌发与代谢的影响,以期为提高药材质量与均一可控性提供依据。同时以全国不同产地穿龙薯蓣种子为研究对象,对其分级方法进行研究,为穿龙薯蓣种子分级标准的建立提供依据。材料与方法:1材料:本课题实验材料为不同产地的27批穿龙薯蓣种子,经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为薯蓣属植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino种子,其根茎入药,药材称为穿山龙。2方法:2.1查阅古籍完成了穿山龙的本草考证并进行薯蓣属药用资源研究。2.2采用培养皿纸上发芽法进行萌发试验,并于相应时间点收集样品。利用人工气候箱模拟不同温度环境,测定相应温度条件下不同阶段可溶性糖与丙酮酸两种初生代谢产物,原薯蓣皂苷、原纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷五种次生代谢产物含量,根粗、茎粗等七项生长及生理指标,以及HMGR、FPS、CAS三种关键酶基因表达量,比较各成分间与指标间相关性及不同温度条件下各成分变化情况。2.3基于不同光照周期条件,采用紫外分光光度法测量穿龙薯蓣种子萌发过程中初生代谢产物产物含量,采用高效液相色谱法测量次生代谢产物含量,采用实时荧光定量PCR扩增法测定关键酶的基因表达量,利用游标卡尺和叶绿素测定仪测量其生长及生长及生理指标,并对所得结果进行相关性分析。2.4基于不同光质条件,采用紫外分光光度法测量穿龙薯蓣种子萌发过程中初生代谢产物含量,采用高效液相色谱法测量次生代谢产物含量,采用实时荧光定量PCR扩增法测定关键酶的基因表达量,利用游标卡尺和叶绿素测定仪测量其生长及生长及生理指标,并对所得结果进行相关性分析。2.5汇总数据,通过灰色关联度法进行不同类型环境间的横向比较,选取主要指标,即初生代谢产物、次生代谢产物、关键酶进行分析,探求各指标与温度、光照周期、光质间的密切程度。2.6参照《农作物种子检验规程》,对穿龙薯蓣种子净度、含水量、百粒重、发芽率、生活力等指标进行测定,采用主成分分析、聚类分析、判别分析等方法将穿龙薯蓣种子分为不同等级,并得到穿龙薯蓣种子的分级判别式。结果:1通过查阅古籍完成了穿山龙的别称考证、基原植物考证、产地考证、功效考证,完成了其近缘药用植物功效研究。2相关性分析结果表明,初生代谢产物、次生代谢产物含量与HMGR、FPS基因表达量直接呈现显著的正相关关系,说明随着穿龙薯蓣幼苗初生代谢产物的增加、关键酶活性的增强,次生代谢产物也随之增加,进一步验证次生代谢产物是由可溶性糖、丙酮酸等转化而来,丰富的初生产物有利于次生代谢产物的累积,且在不同温度的影响下,次生代谢产物含量与HMGR、FPS的基因表达量密切相关,即不同温度条件主要通过调节HMGR、FPS的基因表达量来调控次生代谢产物的生成。同时通过折线图可以直观地看出原薯蓣皂苷累积的最适温度为20℃,原纤细薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷最适温度为25℃,甲基原薯蓣皂苷最适温度为30℃,薯蓣皂苷最适温度为15℃。3各指标实验结果表明,在不同光照周期影响下初生、次生代谢产物均在日夜光照条件下增长速度最快,累积量显著高于其他分组。由此证明,长时间光照更有利于药材质量的形成。可溶性糖与五种次生代谢产物均存在一定的正相关关系,丙酮酸与薯蓣皂苷呈显著正相关关系。FPS、CAS与次生代谢产物存在正相关关系,说明在光照周期的影响下,次生代谢产物含量与FPS和CAS的基因表达量密切相关,即不同周期的光照条件主要通过调节FPS、CAS的基因表达量来调控次生代谢产物的生成。4各指标测定结果表明,可溶性糖在全光谱白光作用下累积量最多,薯蓣皂苷在红光环境下累积最多,丙酮酸以及其他四种次生代谢产物均在白光条件下累积最为显著。可溶性糖与原薯蓣皂苷、原纤细薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷均呈现正相关关系,丙酮酸与几种产物均无显著相关关系。FPS与原纤细薯蓣皂苷、薯蓣皂苷呈正相关关系,CAS与原纤细薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷呈正相关关系。5通过灰色关联度分析法得出,可溶性糖、原薯蓣皂苷、原纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷的含量及HMGR、FPS、CAS基因表达量均与每日光照时间(即光周期)关系最密切,说明药材栽培种植过程中可以通过控制光照周期最大程度上控制以上成分。6种子净度、含水量、百粒重、发芽率、生活力可作为穿龙薯蓣种子分级的参考指标,依据这些指标将全国不同产地27份种子分为2级,并得到穿龙薯蓣种子等级的判别式。结论:1通过查阅古籍对穿山龙进行别称考证、基原植物考证、产地考证、功效考证,我们发现,穿山龙距今已有近200年的用药历史,虽然药用历史不是很长,但是在全国各地应用广泛,而且民间应用很多。所以考证穿山龙的药用记载,明确穿山龙在各地区的药用名称尤为重要,这为穿山龙的广泛使用提供依据,为今后穿山龙的进一步开发奠定基础。通过对其近缘性药物的研究表明,薯蓣属多种植物均含有大量的薯蓣皂苷,可以作为抗肿瘤、抗血栓形成、抗过敏、抗病毒和抗休克新药的重要原料。2种子的好坏是保证其原药材质量优劣的重要前提,种子是个体植株的雏形,萌发被认为是植物一生中最重要的时期,因此,探究种子萌发过程的生理生化及代谢情况对穿龙薯蓣植物生长、药材品质均具有重要的意义。本研究首次对穿龙薯蓣萌发过程中初生、次生代谢产物及关键酶基因表达量进行了测定,并得到了萌发过程中各成分间的相关性结果,证明植株生长发育过程中初生代谢产物在关键酶的作用下转化生成次生代谢产物。通过比对不同温度对次生代谢产物的影响得出,不同温度下各成分含量累积量不同。提示我们可以通过控制温度来调控关键酶活性,进而调控某次生代谢产物含量,控制药材质量。3药用植物的有效成分通常是其累积的次生代谢产物,光照周期对穿龙薯蓣种子萌发与代谢影响的实验表明,更长时间的光照有利于次生代谢产物的积累,即更长时间的光照有利于药材质量的提高。此结论可应用于中草药栽培种植产业,通过人工干预增加光照时间提高药材质量。4本实验研究发现,薯蓣皂苷在红光作用下累积最多,其余四种皂苷均在白光作用下累积最多。因此农业生产时可人工干预不同光质的光源来控制不同皂苷类成分的含量,以控制药材质量。这对提高药材质量,控制药材质量均一化具有重要意义。5通过灰色关联度分析法得出,穿龙薯蓣种子萌发期间各成分含量与每日光照时间(即光周期)关系最密切,说明药材栽培种植过程中应首先满足足够的光照时间这一条件,可以通过控制光照周期最大程度上控制各成分含量。这对穿龙薯蓣药材栽培与种植有重要指导意义。6优质的中药材种子是药材产量和质量的重要保障,也是中药材规范化生产的重要源头。本研究首次采用了系统聚类、主成分分析、判别分析三种分析方法结合,对穿龙薯蓣种子进行分级,并得到了种子质量等级的判别式,为提高药材质量、落实中药材规范化生产奠定基础。