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免疫介导炎症损伤是HBV感染相关的慢加急性肝衰竭的重要特征。Th17细胞分泌的白介素(IL)17参与肝损伤,其活化被认为在HBV相关的慢加急肝衰竭的发病中发挥了重要作用,但目前对于慢加急肝衰竭中Th17细胞活化的促发原因仍不十分清楚。对自身免疫性疾病的研究显示,Toll样受体通路参与促进Th17细胞的分化形成及疾病的发生发展。目前,对于Toll样受体通路在HBV感染相关的慢加急性肝衰竭发病中的作用及其对Thl7细胞分化影响的研究仍为空白。本研究以HBV相关的慢加急肝衰竭患者为研究对象,系统分析了T细胞上Toll样受体的表达状况,比较Toll样受体与肝损伤指标的相关性,并探讨了Toll样受体2表达对慢加急肝衰竭患者体内Th17细胞活化及其功能的影响。本研究对阐明HBV相关的慢加急肝衰竭发病机制及寻找新的免疫治疗方案提供重要的线索和理论依据。目的1.本研究通过对Toll样受体家族中(TLR1-10)在健康对照、HBV感染相关的慢加急性肝衰竭和慢性乙肝患者外周血单个核细胞上表达状况和T细胞上TLR2/4表达,全面分析不同研究对象Toll样受体的表达差异,且比较Toll样受体的表达与肝损伤参数和HBV病毒学参数的相关性。2.体外用Toll样受体2配体(Pam3Csk4)刺激HBV感染相关的慢加急性肝衰竭及慢性乙肝患者外周血T细胞,检测刺激前后Th17细胞及分泌细胞因子表达状况变化,判断刺激后,TH17细胞表达与临床生化指标之间的相关性。3.纵向观察体外用Toll样受体2配体(Pam3Csk4)刺激HBV感染相关的慢加急性肝衰竭外周血T细胞,检测Th17细胞及其分泌细胞因子表达变化,分析TLR2及IL-17的表达变化及疾病发展之间的相关性,从而探讨TLR2在Th17应答及致病之间的作用,为阐明Th17在HBV感染相关的慢加急性肝衰竭中致病机制提供实验及理论基础。方法1.本实验选取协和感染性疾病科门诊或住院诊疗的44例HBV感染者为研究对象,其中22例为HBV感染相关的慢加急性肝衰竭(ACLF)患者,22例为慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者。另选取20例健康对照者。本研究获得武汉协和医院伦理学会批准及所有研究对象均签订知情同意书,并排除其它病毒合并感染。2.受试对象肱静脉血用肝素钠抗凝管采取,用Ficoll密度梯度离心法,获得外周血单个核细胞,分离后的细胞用TRIZOL法提取RNA,用于扩增TLR1-TLR1O基因表达。3.分离后的部分PBMC在96孔-U-型板上,培养4小时,分别根据需要加入佛波酯(phorbol-12-myristate13-acetate, PMA),离子霉素(Ionomycin),或佛波酯,离子霉素及TLR2配体(Pam3Csk4, P3C),同时设加入培养基的孔为阴性对照。培养后细胞通过流式染色技术检测CD4+T细胞表面的TLR2表达,经穿孔破膜后染色检测1L-21, IL-22, IL-17, IFN-γ及TNF-a的表达。4.分离后的部分PBMC在96孔-U-型板上,通过流式染色技术检测CD4+T细胞及CD8+T细胞表面TLR2/TLR4表达。5.通过酶联免疫吸附实验检测病毒标志物：乙肝三系；丙肝抗体；艾滋病抗体等6.临床生化指标来源于协和医院检验科。7.用统计学软件SPSS17.0对实验数据进行统计分析,所用的方法为曼惠特尼U检验(Mann-Whitney U test),威氏配对符号秩检验(Wilcoxon matched pairs test)斯皮尔曼秩相关性检验(Spearman rank correlation)等,p值<0.05认为有显著差异性。结果1.通过RT-PCR方法检测慢加急肝衰竭患者、慢性乙肝患者及健康者TLR1-10mRNA的总体表达谱,结果显示,与健康对照相比,ACLF患者TLR1/2/4/5/6/10mRNA表达明显增高,CHB患者TLR1/2/3//4/5/6/8/9/10mRNA表达明显增高,且TLR2/4表达明显高于其他TLRs;与慢性乙肝患者相比,ACLF患者TLR2/6mRNA表达明显增高,而TLR8/9mRNA表达低于CHB患者。2.将上述HBV感染患者,按照HBeAg+及HBeAg患者分类,比较TLR1-10mRNA总体表达谱,结果显示：与健康对照相比,HBeAg+/HBeAg患者TLR2/4/5/6/8/9/10mRNA表达明显升高,且以TLR2/4表达最高。虽然HBeAg+患(?)TLR2/4/5/6/8/9/10mRNA表达明显低于HBeAg-患者,但其差异无统计学意义。3.流式细胞术检测慢加急肝衰竭患者、CHB患者及健康者外周血PBMC中CD4+T细胞与CD8+T细胞上TLR2/4的表达,结果示：CD4+T细胞上TLR2/4表达在ACLF组明显高于CHB组和健康对照组：CHB组CD4+T细胞上TLR2表达高于健康对照组。CD8+T细胞上TLR2/4表达在ACLF组明显高于CHB组和健康对照组；CHB组CD8+T细胞上TLR2表达高于健康对照组。4. TLR1-10mRNA表达水平与临床生化指标的相关性分析,结果显示：在慢性乙肝患者中,TLR3mRNA表达与HBV DNA表达呈正相关,TLR7mRNA表达与血清ALT水平呈正相关。5.HBV感染患者中,CD4+T细胞及CD8+T细胞上TLR2/4表达与临床指标总胆红素(total bilirubin, TBIL),直接胆红素(direct bilirubin, DBIL),碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP),国际标准化值(International Normalized Ratio, INR)呈正相关,与白蛋白(Albumin, ALB)呈负相关。此外,CD4+T细胞与CD8+T细胞上TLR2表达与谷氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST),凝血酶原时间(prothrombin time, PT),白细胞(white blood cell, WBC)呈正相关,总蛋白(Total Protein, TP),血小板(platelet, PLT)呈负相关。CD4+T细胞上TLR4表达与凝血酶原时间(PT)、白细胞(WBC)呈正相关。6.慢加急肝衰竭患者PBMC中IL-17mRNA的表达明显高于慢性乙肝患者及健康对照。7.慢加急肝衰竭患者PBMC中IL-17mRNA表达与总胆红素及直接胆红素呈正相关。8.慢加急肝衰竭患者外周血Th17细胞的频率增加,明显高于慢性乙肝患者及健康对照组。9.慢加急肝衰竭患者、慢乙肝患者和健康对照者PBMC在体外用TLR2配体刺激后：1)慢加急肝衰竭和慢乙肝患者CD4+T细胞上IL17表达明显增加,但是健康对照组刺激前后IL-17表达没有统计学差异。2)Th17细胞分泌的细胞因子(IL-22, IL-21)及促炎因子(IFN-γ, TNF-a)明显增加,但是在健康对照组没有统计学差异。3)慢加急肝衰竭患者上述细胞因子的表达高于慢性乙肝患者和健康对照组,但是IFN-γ的表达没有统计学差异。4)慢加急肝衰竭患者Thl7细胞的表达频率与总胆红素,直接胆红素呈正相关,与白蛋白呈负相关。5)慢加急肝衰竭患者TH17细胞表达频率与TLR2表达呈正相关。10.纵向观察慢加急肝衰竭患者伴随病情的发展,其CD4+T细胞上IL-17及TLR2的表达状况,显示：随着病情的加重,IL-17A的表达与TLR2的表达增加。但是伴随着病情的好转,IL-17/TLR2表达明显降低。结论1.慢加急肝衰竭患者外周血TLR2/4mRNA表达及TLR2/4蛋白表达水平明显高于慢性乙肝患者和健康对照组。提示慢加急肝衰竭患者体内存在天然免疫的活化及感染的存在。2.慢加急肝衰竭患者外周血Th17频率及分泌的细胞因子明显高于慢性乙肝患者及健康对照组,提示Thl7参与慢加急肝衰竭患者的肝损伤。3.慢加急肝衰竭患者Th17细胞的表达频率及分泌的细胞因子,在TLR2配体刺激下明显增加。Thl7表达与临床病情重症指标相关,且TH17细胞表达频率与TLR2表达呈正相关,提示慢加急肝衰竭患者体内Th17细胞的活化的机制可能是TLR2参与启动Th17细胞的反应,加重对慢加急肝衰竭患者的肝损伤。本研究的创新点4.本研究立足于文献报道的研究成果,充分依据现有的理论基础,创新性提出将天然免疫(Toll样受体(TLR2))与获得性免疫(Th17细胞)为研究对象,研究它们在慢加急肝衰竭患者中表达状况,及与临床疾病进展之间的关系,探讨TLR2可能参与Th17细胞在慢加急肝衰竭患者中的致病作用,而有关这方面的研究目前尚无相关的研究报道。5.通过TLR2配体刺激慢加急肝衰竭患者的PBMC,检测Th17细胞的表达频率及分泌的细胞因子表达增加,及其与临床检测指标的相关性,为探讨慢加急肝衰竭患者Thl7致病机制提供重要的理论基础,为慢加急肝衰竭患者的临床检测及治疗提供新的靶点。