【研究背景及目的】新生隐球菌是一种临床上主要导致免疫抑制患者产生隐球菌病的重要致病真菌。新生隐球菌的典型感染途径为把干燥的担孢子或酵母吸入肺泡中,在免疫正常人则引起轻微感染或无症状感染。此外新生隐球菌有显著嗜神经性,其可传播至中枢神经引起可威胁生命的隐球菌性脑膜脑炎,因此,肺内吞噬细胞主要包括巨噬细胞,在决定能否阻止新生隐球菌传播到中枢,是否引起威胁生命的脑膜脑炎的过程中起重要作用。microRNA(miRNA)是由19-24个核苷酸组成的非编码RNA,在转录后水平调节着多个靶基因的表达。其中miR-155在炎症和肿瘤方面均参与调节作用。它由众多的炎症介质比如TNF-a和脂多糖等通过固有免疫调节。miR-155在多种被激活的免疫细胞中均有表达,包括在决定新生隐球菌能否传播到中枢的肺泡巨噬细胞中也有表达,及其他的免疫细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞及DC细胞,已知的miR-155的众多靶转录产物包括促凋亡和抑炎蛋白,如Fas死亡结构域相关蛋白,Ik B激酶和SOCS1。细胞因子信号转导抑制因子包括CIS及SOCS1-7,是一类免疫抑制分子家族,它们均由细胞产生并能够反馈性地阻断细胞因子信号传导过程的负性调节因子,其可调节多种细胞因子,在多种人体炎性疾病过程中均有参与调控。其中SOCS1,又名SSI-1(STAT-induced STAT inhibitor-1),其可由多种细胞因子诱导而产生,又可反过来抑制众多促炎症因子如TNF-α,IL-6,IFN-γ等,是JAK/STAT通路上重要的负性调节因素。既往的研究发现在脂多糖以及病毒诱导的巨噬细胞炎症反应中,均可观测到miR-155的上调,并且能观测到抑制其靶基因SOCS1。在我们所关注的新生隐球菌感染的炎症反应中,miR-155是否影响SOCS1,是否影响炎症因子如TNF-α,IL-6的调节仍不明确,因此在本研究中,我们用热灭活的新生隐球菌刺激单核巨噬细胞RAW264.7,观察miR-155靶向SOCS1的表达变化及调控规律,分析在新生隐球菌诱导的炎症反应中是否也存在miR-155靶向SOCS1的免疫调节机制,探索其是否也在隐球菌病的发病机制中承担一定的作用。第一部分:新生隐球菌诱导巨噬细胞中miR-155表达水平、TNF-α、IL-6表达水平的检测。为了明确在新生隐球菌刺激下的巨噬细胞内miR-155水平是否对炎症因子有影响,我们用新生隐球菌(标准株WM148)与巨噬细胞(RAW264.7细胞系)共孵育,分别在第0、3、6、9、12小时后收集细胞及其上清液,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测巨噬细胞miR-155,使用ELISA法检测上清液中炎症因子TNF-α和IL-6的表达量,并观察其变化规律。结果:在新生隐球菌与巨噬细胞共孵育0、3、6、9、12小时后,测得miR-155的表达量明显升高(P<0.05),而同时细胞因子TNF-α、IL-6的表达量呈时间依赖表达增加,然而后期增幅并不明显。第二部分:新生隐球菌诱导巨噬细胞中SOCS1基因和蛋白层面表达的检测miR-155重要的靶基因为SOCS1,为了明确在新生隐球菌诱导的巨噬细胞中,是否SOCS1确实有调控作用,我们使新生隐球菌与巨噬细胞共孵育,分别在第0、3、6、9、12小时后收集细胞,通过实时荧光定量PCR检测巨噬细胞SOCS1的基因表达量,Western blot检测SOCS1蛋白的表达量。结果:新生隐球菌与巨噬细胞共孵育0、3、6、9、12小时后,SOCS1基因表达量增加明显(P<0.05),但SOCS1蛋白表达不明显。第三部分:通过转染抑制巨噬细胞miR-155后SOCS1表达的影响为进一步探讨在新生隐球菌作用下巨噬细胞中miR-155对其靶基因SOCS1的影响,我们给RAW264.7细胞系转染miR-155的siRNA以抑制miR-155表达后,再一次新生隐球菌共孵育诱导,时间设定分别为第0、3、9小时,通过实时荧光定量PCR检测巨噬细胞SOCS1的表达量,Western blot检测SOCS1蛋白的表达量。结果:抑制miR-155表达后的巨噬细胞与新生隐球菌共孵育诱导测得在第3、9小时SOCS1的基因和SOCS1蛋白的表达都有显著增加,同抑制miR-155表达后共孵育0小时比较有统计学意义。【结论】我们研究结果显示新生隐球菌诱导巨噬细胞后,会刺激炎症因子如TNF-α、IL-6等的释放,并会触发机体一系列的负反馈机制的激活。在炎症因子的刺激下SOCS1基因的表达已被激活,但我们观察到SOCS1蛋白的表达没有明显的增加,表明在某些信号通路上有抑制SOCS1激活基因转录机制的存在。正是由于这种机制的存在,有效避免了在炎症表达的初期,负反馈机制过度的抑制抗炎因子产生,而不能发挥正常适度的巨噬细胞抵抗病原菌的作用。本实验通过抑制miR-155的基因表达,观察miR-155对靶基因SOCS1的调控作用。我们发现转染siRNA后,抑制miR-155的表达,在新生隐球菌诱导3 h、9 h后,SOCS1基因的表达增加,同时SOCS1蛋白有相应的增加,结果表明miR-155表达抑制以后,部分解除对SOCS1基因转录水平的抑制。说明miR-155对SOCS1确实存在一定程度的抑制作用。综上所述,我们实验表明在新生隐球菌被吸入肺泡后在巨噬细胞炎症反应的早期,在炎症因子TNF-a、IL-6的诱导下,SOCS-1产生并对巨噬细胞产生的炎症反应起到负反馈调节,以调控适度的免疫反应。而SOCS-1是miR-155的靶基因之一,本研究表明,在新生隐球菌诱导的巨噬细胞炎症反应过程中,SOCS1的细胞因子信号传导抑制的作用发挥受到miR-155的负向调控。有效的避免了在炎症表达的初期,负反馈机制过度的抑制抗炎因子产生,而不能发挥正常适度的巨噬细胞抵抗病原菌的作用。正是这些环环相扣的调节机制使得免疫反应能适度地、正常地发生。