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低温寒害是目前世界上对植物生长影响较严重的自然灾害之一。植物在生长发育过程中常受到低温寒害,导致农业产量下降及大批林业树木的冻伤,严重时也可造成死亡,每年由此造成的农林业方面的损失将达数千亿美元。因此提高植物的抗寒能力对减少农林业方面的损失具有重大的意义。传统的育种方法在植物抗逆方面取得了一定的进展,但因基因工程的培育方法具有周期短、见效快的特点而逐渐在植物遗传育种中占据了重要的位置。在运用基因工程的方法改良植物抗逆能力的过程中,最初人们只是想到将单个功能基因转入植物,但是与植物抗逆相关的基因并非只是某一个基因,可能涉及多个同时表达的基因,所以单基因抗性并不显著。CBF/DREB1(CRT/DRE binding factor)作为一种与调节植物冷胁迫相关基因表达的转录因子,它能响应上游低温信号的传导,从而迅速合成,并与相应的顺式作用元件CRT/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)相结合,控制下游相关抗逆基因的表达,促进脯氨酸、糖类和相关膜稳定性蛋白等的合成,从而增强植物的抗逆性。大量研究者发现转CBF基因对其植株的抗逆性均有所增强,这为用基因工程手段增强植物耐寒性提供了一条新途径。本研究首先对不同非生物胁迫下香樟的内参基因进行了筛选,其次以实验室克隆获得的香樟CcCBFs(CcCBFa、CcCBFb、CcCBFc、CcCBFd)基因为基础,对香樟CcCBFs基因在不同非生物胁迫下的表达模式进行了初步研究,之后针对香樟CcCBFs基因的功能也在模式植物转基因拟南芥和烟草中进行了初步的分析,为下一步培育抗逆性增强的转基因香樟新品种奠定基础。本研究的相关成果列举如下:1.以香樟实生苗为材料,利用实时定量PCR技术研究分析了两个香樟候选内参基因CcACTc和CcEF1α在不同非生物胁迫下的表达量,并通过Best Keeper软件对CcACTc和CcEF1α的稳定性进行了分析。结果表明,在低温处理中,CcACTc的稳定性较好,在干旱、高盐和ABA处理中则CcEF1α的稳定性较好,并且其在低温处理中也相对稳定。由此可知,CcEF1α更适合作为内参基因应用于香樟非生物胁迫相关基因的定量分析。2.以保存的香樟无性系EL6组培苗为实验材料,采用荧光定量PCR技术,分析其在不同非生物胁迫下的表达量。结果表明,低温胁迫中,香樟CcCBFc基因在峰值时表达量显著高于CcCBFa、CcCBFb和CcCBFd基因,在持续胁迫72 h后,香樟CcCBFd基因的表达量仍较平稳且高于对照;干旱胁迫中,香樟CcCBFa和CcCBFb基因的响应较迅速,而香樟CcCBFc和CcCBFd基因的表达量较高;高盐胁迫下,香樟CcCBFb和CcCBFc基因的表达较显著。综上所述,对不同非生物胁迫的反应,香樟CcCBFc和CcCBFd基因的诱导更为敏感。3.通过花序侵染法获得T2代转香樟CcCBFs基因的拟南芥种子,然后对其在不同非生物胁迫下的幼苗发芽率及平均根长的分析结果可知:在低温和干旱胁迫中,转香樟CcCBFd基因拟南芥的发芽率及平均根长均较野生型好,其次为转香樟CcCBFc基因的拟南芥;在高盐胁迫下,转香樟CcCBFs基因的发芽率均较低,但转香樟CcCBFd基因的拟南芥的发芽率具有微弱的优势。由此可见,在低温、干旱和高盐胁迫下,转香樟CcCBFd基因的拟南芥抗逆性更强。4.通过农杆菌介导获得三个转香樟Cc CBFs基因的T1代烟草植株(目前转香樟CcCBFd基因的烟草仅获得其T1代种子),对其抗逆生理的测定结果可知:在低温胁迫下,转基因烟草均具有不同程度抵御低温胁迫的能力,其中转香樟CcCBFc基因的烟草抗寒性较强,其次为转香樟CcCBFa基因的烟草;在干旱胁迫中,转香樟CcCBFa基因的烟草耐旱性最好,转香樟CcCBFb基因的烟草次之;在高盐胁迫中,转香樟CcCBFa和CcCBFc基因烟草的耐盐性均较强。由此可见,转香樟CcCBFa和CcCBFc基因的烟草在低温和高盐胁迫下的抗性较强,而转香樟CcCBFa和CcCBFb基因的烟草抗旱性较强。