目的:慢性骨髓炎难治愈,给患者带来了巨大的痛苦和昂贵的经济负担。慢性骨髓炎的治疗周期需要多次手术而且较长的住院时间,很多病例难以完全根治,会影响患者的生活质量以及社会的经济发展。以往认为,金黄色葡萄球菌是骨髓炎中的主要致病菌。对慢性骨髓炎致病菌谱的研究总结可以发现,目前革兰阴性杆菌比例不断升高,所以对革兰阴性杆菌在慢性骨髓炎疾病发展过程中的具体机制应该进一步研究,为针对性的疗法提供新的思路。能够代谢有机硫化物的酶普遍存在于微生物中。微生物通过释放硫化氢使硫化氢参与到微生物的许多生理过程中,例如防御抗生素,信号传递和能量代谢。与微生物相似,人体内也有多种代谢产生硫化氢的酶。硫化氢被认为是继一氧化氮和一氧化碳以后的第三种内源性信号气体分子。然而,关于硫化氢在骨髓炎感染过程中的具体作用尚不清楚。第一部分研究拟探索几种慢性骨髓炎中常见的革兰阴性杆菌在体外及体内的硫化氢释放情况,确认其释放硫化氢的浓度,并为后续的研究提供理论及实验基础。在骨髓炎期间,由于骨基质合成减少和成骨细胞凋亡率增加,新骨沉积减少,导致骨质丢失。细胞外细菌成分可能会减少成骨细胞。细胞质炎性体激活可能与自分泌/旁分泌死亡受体配体信号协同作用以诱导细胞死亡。所以,控制感染骨细胞的凋亡途径可能是限制骨髓炎炎症损伤的一种有吸引力的新方法。革兰阴性菌的主要致病物为内毒素。内毒素可以通过直接或者间接作用促进成骨细胞凋亡。Caspase家族蛋白的高度表达是凋亡发生的重要标志。凋亡启动后,细胞内底物分裂、染色质浓缩、DNA断裂、以及最终细胞死亡。除了促凋亡作用的Caspase家族,细胞的凋亡过程还受到Bcl-2家族蛋白的抗凋亡作用。目前,针对细菌性骨破坏的有效治疗仅限于抗生素方案和外科手术策略来治疗感染性骨疾病。因此研究可能恢复成骨细胞功能下降的药物仍是预防感染性骨疾病骨质破坏的主要目标。第二部分研究通过探讨革兰阴性菌产生硫化氢对其引起成骨细胞凋亡的作用,试图为新的治疗方案提供新的思路。细胞的凋亡受其内在多种信号通路的调节。近年来,PI3K/AKT信号通路已被发现在细胞多项生理活动的调节过程中起到重要作用,研究发现AKT在多种细胞中起到抗凋亡作用。另外AKT通路还可以与其他信号通路互相作用,起到抑制凋亡的作用。AKT通路下游涉及到多个信号通路。NF-κB相关通路就是其中重要的一个信号通路。激活的AKT可以磷酸化的IKK,进而磷酸化与NF-κB相连的IκB。IκB作为转录因子可以调控一系列基因表达。对AKT通路的抑制会引起对NF-κB通路的抑制,进而使细胞中生存因子的表达降低,促进细胞凋亡。多个实验发现硫化氢可以抑制AKT的磷酸化,因此,第三部分实验要验证是否硫化氢通过抑制AKT磷酸化及下游NF-κB通路激活,促进了凋亡蛋白的表达,加剧了成骨细胞的凋亡。研究方法:在体外NB培养基中培养三种细菌大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷氏肺炎杆菌,分别用平板计数法制备106CFU/mL浓度的三种细菌悬液备用。将NaHS梯度稀释浓度,作为标准比较硫化氢在醋酸铅试纸上产生黑色沉淀的量。比较不同菌液和NaHS组37℃过夜后试纸上产生的黑色沉淀,估计三种细菌在培养基中产生硫化氢的量。取40只SD大鼠根据随机数法分出对照组和大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷氏肺炎杆菌三种细菌实验组,每组10只。腹腔麻醉后胫骨钻孔后根据分组注射入细菌悬液或无菌NB培养基。术后三周经腹腔过量麻醉处死。处死后取大鼠胫骨标本固定后进行HE染色。并取病灶周围组织进行组织硫化氢含量测定。培养MC3T3-E1和hFOB两种成骨细胞细胞系。将MC3T3-E1和hFOB分别用梯度浓度硫化氢供体单独处理或者与LPS共同处理,培养2天后进行MTT检测,比较硫化氢单独处理或者与LPS共同处理时对细胞增殖能力的影响。将成骨细胞分为三组:(1)对照组;(2)LPS单独处理组以及(3)LPS合并硫化氢共同处理组。对三组进行流式细胞学检测、Hoechst染色以及Western blot,观察不同情况成骨细胞凋亡情况以及凋亡相关蛋白表达情况。三组细胞处理后,更换成骨诱导培养基培养,进行ALP及qPCR检测,观察不同情况对成骨细胞成骨能力的影响。对三组进行免疫荧光及Western blot检测,观察不同情况下细胞中AKT/NF-κB通路相关蛋白的表达情况。应用AKT激活剂后,进行流式细胞学,qPCR,ALP及茜素红检测,进一步检验AKT通路在凋亡及成骨过程中的作用。结果:1、革兰阴性菌可以在体外释放硫化氢,本研究的三种革兰阴性菌:大肠杆菌、阴沟肠杆菌和克雷氏肺炎杆菌,在NB培养基中均可以产生硫化氢,而且产生硫化氢的浓度在50-100μM之间。大鼠骨髓炎模型HE染色后,在镜下可见三种细菌感染后的骨组织中可见炎症细胞浸润及骨小梁结构破坏,说明细菌感染造模成功。用硫化氢检测试剂盒检测。结果显示三种细菌感染后骨髓炎局部组织中的硫化氢浓度明显升高。上述实验结果表明,大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷氏肺炎杆菌三种慢性骨髓炎常见的革兰阴性菌在体内及体外均可以产生硫化氢。2、硫化氢促进LPS对成骨细胞的凋亡作用,而且加重LPS对成骨细胞增殖和成骨功能的抑制。用两种不同浓度的硫化氢供体分别处理两种成骨细胞,与对照组相比,两种成骨细胞的增值率在硫化氢0-100μM范围内均无明显降低。然而,硫化氢与LPS共同作用时,两组细胞系内的增值率均有所下降,而且呈剂量相关。说明硫化氢可以加重LPS对成骨细胞增殖的抑制效果。与LPS单独处理组相比,硫化氢与LPS共同处理组凋亡率降低而且的Hoechst染色结果显示凋亡细胞数增加,另外凋亡相关的蛋白表达也有所增加。这些结果都说明硫化氢可以促进LPS对成骨细胞凋亡作用。诱导成骨后的qPCR及ALP检验结果显示硫化氢及LPS组合组较LPS组中,成骨细胞成骨相关基因的表达以及产生ALP的量降低。这提示硫化氢能加强LPS对成骨功能的抑制。应用FAS特异性抑制剂后,成骨细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白表达降低,说明硫化氢过FAS凋亡通路影响成骨细胞的凋亡过程。3、硫化氢通过抑制AKT/NF-κB信号通路影响LPS对成骨细胞的作用。Western blot及免疫荧光结果显示,硫化氢抑制pAKT及p65蛋白表达。使用pAKT激活剂以后,pAKT表达明显升高。成骨细胞的凋亡率以及成骨能力都明显上升。另外硫化氢抑制COX-2的表达,这可能与硫化氢对成骨功能的抑制有关。结论:1、慢性骨髓炎中常见的革兰阴性菌在体外及体内都可以释放硫化氢,体外释放浓度在50-100μM之间;2、在硫化氢作用下,内毒素对成骨细胞的增殖与成骨作用起抑制作用;3、在硫化氢作用下,内毒素对成骨细胞的促凋亡水平提高;4、硫化氢与内毒素对成骨细胞的促凋亡机制与FAS凋亡通路有关;5、硫化氢通过抑制AKT/NF-κB通路引起对成骨细胞的促凋亡作用。