论文部分内容阅读
近年来,D-阿洛糖(D-Allose)由于其具防止肥胖、抗氧化、抗高血压、抗肿瘤以及抗癌症功能,而受到越来越多的关注。目前,以Izumoring酶法指导生产D-阿洛糖的研究较为广泛。相比于以D-阿洛酮糖为底物,利用D-果糖为原料,经D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)和L-鼠李糖异构酶(L-rhamnose isomerase,LRI)作用生产高附加值D-阿洛糖,将成为更加认可的生产路线。酿酒酵母一直被美国FDA(Food and Drug Administration)认为是GRAS(Generally Recognized As Safe)生产菌株,具备安全无致病性、遗传背景清晰、培养简单和繁殖迅速等优势,因此以酿酒酵母为宿主生产D-阿洛糖在确保食品安全性等方面具有相当大的优势。由于酿酒酵母体内的己糖激酶同工酶2(Hexokinase isoenzyme 2,HXK2)可以将果糖磷酸化果糖-6-磷酸,因此有必要将其缺陷而构建果糖低消耗宿主菌株,从而提高D-阿洛糖的产量。具体研究方法和结果如下:(1)酿酒酵母中高效CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建构建了rDNA整合型Cas9和游离型Cas9系统,通过以磷酸核糖甲酰胺咪唑羧化酶基因ade2(Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase)为例,对其进行编辑以评估二者的编辑效率。基于酿酒酵母磷酸甘油酸激酶基因PGK1组成型强启动子(PPGK1)表达的Cas9,首先构建了rDNA整合型Cas9表达酿酒酵母菌CS1,随后构建了靶向ade2(编码磷酸核糖甲酰胺咪唑羧化酶基因)的gRNA,得到了高拷贝游离型表达的质粒p RS426-gRNA-?ade2,进而将脂肪酶基因tll2(Thermomyces lanuginosus lipase)表达盒整合至ade2位点,得到敲除菌CS-2。另外,构建了靶向ade2的Cas9/gRNA共表达游离型质粒p YES2-CG-?ade2,进而将tll2(Thermomyces lanuginosus lipase)表达盒转化至酿酒酵母菌BY4741,得到了酿酒酵母细胞ade2基因敲除菌CS-3。实验表明,菌株CS-3可以通过质粒丢失达而到无痕编辑;在编辑效率方面,整合型Cas9为70%,而游离型Cas9的编辑效率为100%。综上说明游离型Cas9系统具有更好的编辑效果,在接下来的基因编辑将使用此系统。(2)基于CRISPR/Cas9构建酿酒酵母果糖低消耗宿主菌构建了靶向酿酒酵母己糖激酶2 hxk2基因的Cas9/gRNA共表达游离型质粒p YES2-CG-?hxk2,实现己糖激酶同工酶2移码突变及提前终止,得到突变菌株BY4741-?hxk2。果糖发酵实验结果表明,发酵培养22 h,BY4741-?hxk2的OD600值为8.65,相比于野生型提高了6.40%。另外,发酵培养14 h中,缺陷株BY4741-?hxk2果糖消耗速率为3.35mg?h-1;与野生型菌株相比其下降了6.42%。因此,BY4741-?hxk2不仅一定程度提高细胞的数量,而且对果糖消耗速率也有所减缓,这将有利于后续的D-阿洛糖在酿酒酵母中生产。(3)D-阿洛糖在酿酒酵母中的生物合成经酿酒酵母密码子优化,合成来源Dorea sp.CAG317的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe和来源Clostridium stercorarium的L-鼠李糖异构酶基因lri,构建了含有hxk2位点上下游同源臂的dpe和lri串联表达盒PTEF1-lri-TCYC1-PPGK1-dpe-TADH3,将其和质粒p YES2-CG-?hxk2导入酵母中,从而使dpe和lri串联表达盒整合进入hxk2位点,得到D-阿洛糖生产工程菌株Y1。对工程菌株Y1进行发酵实验,经HPLC检测,得到与标准品D-阿洛糖相同出峰时间的特征峰,初步判断该特征峰为D-阿洛糖;经计算,该物质的含量为1.69 g/L。