论文部分内容阅读
目的:六价铬是与肺癌等肺部疾病相关的重要人类致癌物质。暴露于六价铬可诱导人肺上皮细胞的DNA损伤以及恶性转化。尽管人们对六价铬的致癌机理进行了广泛的研究,其分子机制尚未完全明确,而且对于六价铬诱导的细胞转化是否可能伴随侵入特性以促进转移还不清楚。因此,本研究旨在通过构建六价铬体外诱导人支气管上皮细胞Beas-2B恶性转化细胞模型,探讨:1.六价铬对Beas-2B增殖活性的影响;2.六价铬短期诱导对人支气管细胞Beas-2B迁移、侵袭以及相关蛋白的影响;3.六价铬长期诱导对人支气管上皮细胞Beas-2B迁移、侵袭以及相关蛋白的影响;4.六价铬长期诱导人支气管上皮细胞Beas-2B是否发生恶性转化;5.抑癌基因LKB1在六价铬诱导的稳定转化细胞（Beas-2B-Cr）迁移、侵袭过程中的作用及机制。从而进一步明确六价铬在细胞水平和分子水平的可能的致癌机制,揭示六价铬诱导恶性转化过程中细胞迁移、侵袭的机制,阐明LKB1在细胞恶性转化研究中的作用,从而为重金属致癌分子机制的研究提供良好的模型,也为化学物质的致癌性检测以及职业性肺癌的治疗和预防提供了理论支持和科学依据。方法:1.以不同浓度的重铬酸钾（K2Cr2O7）溶液（0-20μM;0-5μM;0-1μM）处理人支气管上皮细胞不同时间（6、12、24、48、72h）,MTT法和平板克隆实验检测六价铬对细胞增殖活性的影响,筛选六价铬长期诱导的浓度;2.低浓度重铬酸钾（K2Cr2O7）溶液（0.125μM、0.25μM）短期诱导细胞（24h、48h）后,Transwell实验检测六价铬诱导对Beas-2B细胞迁移、侵袭能力的影响,蛋白免疫印迹法检测肺癌抑癌基因LKB1以及迁移、侵袭相关蛋白FAK、Src、MMP-2、GSK3β、β-catenin、HEF1等表达情况;3.软琼脂克隆实验检测六价铬（0.125μM、0.25μM）长期诱导（20、40和60代）人支气管上皮细胞Beas-2B的恶性转化情况,Transwell实验和蛋白免疫印迹法分别检测恶性转化过程中六价铬对细胞迁移、侵袭能力以及相关蛋白FAK、Src、MMP-2、GSK3β、β-catenin、HEF1等表达的影响;4.软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤实验检测六价铬转化细胞Beas-2B-Cr的恶性转化情况,蛋白质组学相关实验检测六价铬转化细胞Beas-2B-Cr差异蛋白的表达;5.Transwell和蛋白免疫印迹法检测六价铬转化细胞Beas-2B-Cr的迁移、侵袭能力以及相关蛋白表达情况;6.分别利用过表达质粒STK11诱导LKB1上调和si RNA基因干扰方法下调LKB1表达的情况下,考察LKB1对细胞迁移、侵袭能力的影响以及LKB1与FAK、Src、MMP-2、GSK3β、β-catenin、HEF1等蛋白之间的关系。结果:1.高浓度六价铬化合物（5-20μM）对人支气管上皮细胞的增殖活性影响较大,且成时间浓度依赖性（P<0.05）,为了消除由于增殖抑制对实验的干扰,选用两个低浓度六价铬0.125μM和0.25μM作为长期诱导以及迁移、侵袭实验的作用浓度;2.Transwell实验结果显示六价铬化合物短期作用24h和48h能够诱导细胞的迁移（P<0.01）,并且随着作用浓度的升高,细胞迁移的能力也随之增强;蛋白免疫印迹实验结果表明LKB1蛋白水平随着六价铬浓度的升高而下降,而迁移、侵袭相关蛋白FAK、Src、MMP-2、GSK3β、β-catenin、HEF1等蛋白水平升高;3.细胞在经过六价铬诱导连续传代20代后可在半固体琼脂上形成克隆,获得锚着独立性生长能力,且具有浓度依赖关系（P<0.05）,克隆的数量和大小随诱导代数的增加而升高。在长期诱导过程中,六价铬始终诱导Beas-2B细胞的迁移、侵袭能力,且成浓度依赖性。LKB1蛋白表达在细胞转化过程中始终受到抑制,而迁移、侵袭相关蛋白表达升高;4.从六价铬诱导60代细胞在软琼脂上形成的克隆,扩大培养获得的细胞株Beas-2B-Cr可以在软琼脂中形成克隆,能够在裸鼠体内成瘤。该细胞株迁移、侵袭能力与对照组相比明显增强（P<0.001）,细胞中LKB1蛋白表达与对照组相比明显下降,但是与迁移、侵袭相关的蛋白表达高于对照组;5.双向荧光差异凝胶电泳的结果表明六价铬转化细胞Beas-2B-Cr与对照组细胞相比有159个差异表达的蛋白点,质谱结果显示35个差异表达显著的蛋白中包括下调的抑癌基因LKB1;6.在LKB1表达低的细胞Beas-2B-Cr中,质粒转染过表达LKB1,可以抑制细胞迁移、侵袭能力,诱导FAK、Src、MMP-2、GSK3β、β-catenin、HEF1等蛋白表达下降;基因干扰LKB1下调蛋白表达,可以促进细胞迁移、侵袭能力的增强,抑制FAK、Src、MMP-2、GSK3β、β-catenin、HEF1等蛋白表达;结论:六价铬对人支气管上皮细胞Beas-2B的增殖活性抑制具有时间浓度依赖关系;六价铬转化细胞Beas-2B-Cr可以在软琼脂中形成克隆,细胞具有肿瘤细胞特征;六价铬转化细胞Beas-2B-Cr在异体移植的小鼠体内诱导肿瘤的发生,细胞具有成瘤性;低浓度六价铬能够诱导人支气管上皮细胞Beas-2B的恶性转化;六价铬长期暴露可以诱导Beas-2B细胞迁移和侵袭能力,并且能够抑制细胞中LKB1以及激活迁移侵袭相关蛋白的表达;迁移、侵袭相关蛋白FAK、Src、MMP-2、GSK3β、β-catenin、HEF1等都是LKB1的下游蛋白并受其调控,从而对Beas-2B-Cr细胞的迁移、侵袭产生影响。