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研究背景胃癌(gastric cancer, GC)是我国人群中常见的恶性肿瘤之一,其发病率仅次于肺癌居第二位[1],也是目前世界上发病率第四位的肿瘤,居消化道恶性肿瘤发病率及病死率第一位[2],是当前危害人民身体健康的重大疾病。胃癌的发生发展是一个多因素、多阶段和多基因参与的复杂病理过程[3],其发病机制仍然不明确。寻找新的肿瘤标志物及基因治疗靶点,阐明胃癌的发生发展机制,对其早期诊治有重要作用。我们前期应用激光捕获显微切割(Laser capture microdissection, LCM)技术联合18O稳定同位素标记定量蛋白质组学技术对胃腺癌的蛋白质组进行研究,构建了胃腺癌差异表达蛋白质谱,首次发现Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein, RKIP)在正常胃粘膜组织中高表达,在胃癌组织中明显下调[4]。通过临床研究发现RKIP蛋白表达与胃癌的发生发展和肿瘤分化有密切的关系[5]。并在此工作基础上,应用亲和纯化偶联质谱技术为主的靶向蛋白质组学,鉴定出SGC7901胃癌细胞中72个RKIP相互作用蛋白质,并筛选出包括14-3-3ε在内的与RKIP抑制肿瘤发生发展作用相关的特异性蛋白[6]。14-3-3蛋白家族是一组胞质内酸性蛋白质,有强大的蛋白结合能力及多样化的功能,主要通过与其它蛋白相结合来发挥其独特的作用[7]。研究表明14-3-3蛋白与癌症的发生和发展密切相关,主要通过调节肿瘤细胞生长、扩散迁移、细胞周期、细胞凋亡及信号转导通路等参与肿瘤的发生发展[8]。随着生命科学研究的不断发展,人们逐渐意识到蛋白质作为细胞生命活动的重要执行者和调控者,其功能的发挥并非仅凭借单个蛋白质独立执行,而是依靠蛋白质与蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)执行其功能[9]。因此,本研究在前期研究的基础上,应用免疫共沉淀、三维免疫荧光共定位等技术,验证14-3-3蛋白家族中ε亚型与RKIP蛋白在胃癌中存在相互作用,并研究两者相互作用对胃癌细胞增殖、侵袭能力的影响及其机制；并初步探讨了14-3-3ε促进胃癌发生发展的分子机理,为胃癌的早期诊断、预后监测及基因治疗提供了理论依据和新的线索。第一章14-3-3ε与RKIP在胃癌中的相互作用及其机制研究目的：验证蛋白RKIP与14-3-3ε之间存在相互作用,探讨两者相互作用对胃癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响及其可能的作用机制。方法：①在胃癌SGC7901中转染质粒pcDNA3.1-PEBP1和(或)质粒pcDNA3.1-YWHAE-HA,用含G418400μg/ml的选择培养基进行筛选,构建稳定表达RKIP和(或)14-3-3ε蛋白的胃癌SGC7901细胞株；②采用双向免疫共沉淀、三维免疫荧光共定位的实验方法验证RKIP与14-3-3ε之间的相互作用；③应用MTT法检测各组细胞的增殖能力,transwell小室实验检测各组细胞的迁移、侵袭能力；④应用Western blotting方法分别检测磷酸化ERK (p-ERK)与total ERK、磷酸化RKIP(p-RKIP)与total RKIP在各组细胞中的表达水平。结果：①成功构建稳定表达RKIP和(或)14-3-3ε蛋白的胃癌SGC7901细胞株；②14-3-3ε可与RKIP发生双向免疫共沉淀反应；③在胃癌SGC7901细胞中,RKIP与14-3-3ε蛋白均定位于细胞膜与细胞质,两者存在明显的共定位关系；④转染24小时后,MTT比色法测定各组吸光度值,与未转染组、空载体转染组及共转染组相比,RKIP转染组A570明显降低(P<0.01),而14-3-3ε转染组A570明显升高(P<0.01);⑤Transwell小室实验观察侵袭迁移细胞数目及比较侵袭率,相对于未转染组与空载体转染组,RKIP转染组侵袭率减低(P<0.01)；相反,14-3-3ε转染组侵袭率显著提高(P<0.01)⑥Western blotting检测SGC7901细胞中总ERK、p-ERK的表达水平,与未转染组、空白质粒组比较,14-3-3ε转染组p-ERK的表达显著提高(P<0.05),而RKIP转染组中p-ERK表达水平降低(P<0.05)；共转染组p-ERK表达水平介于上述两组两者之间；但各组细胞中总ERK表达无明显差异(P>0.05);⑦Western blotting检测SGC7901细胞中总RKIP与p-RKIP表达水平,RKIP转染组虽然总RKIP表达较14-3-3e转染组高(P<0.05),但其p-RKIP表达水平明显减低(P<0.05)；与未转染组、空白质粒组及RKIP转染组比较,14-3-3ε转染组与共转染组中p-RKIP表达水平明显升高P<0.05)。结论：RKIP与14-3-3ε之间存在直接或间接的相互作用；RKIP可通过降低p-ERK的表达使ERK/MAPK信号通路失活从而抑制SGC7901细胞增殖和侵袭,14-3-3ε通过提高p-ERK的表达活化ERK/MAPK信号通路促进SGC7901细胞的增殖和侵袭；14-3-3ε可通过增强RKIP磷酸化表达促进ERK/MAPK信号传导途径的激活。第二章14-3-3ε在胃癌发生发展中的机制研究目的：研究胃癌组织中14-3-3ε的表达与临床意义及14-3-3ε蛋白对胃癌细胞增殖、迁移侵袭能力的影响,探讨14-3-3ε蛋白对胃癌发生发展的作用。方法：①在胃癌SGC7901中转染pcDNA3.1-YWHAE-HA质粒,上调SGC7901细胞中14-3-3ε的表达,应用MTT法、平板克隆形成实验检测各组细胞的增殖能力；流式细胞学检测细胞凋亡率；②应用transwell小室实验检测各组细胞的迁移、侵袭能力；③在湘雅医院病理科选取60例良性胃黏膜组织,93例胃癌组织和30例原发胃癌转移的淋巴结组织得石蜡包埋组织标本,采用免疫组化方法检测标本组织中14-3-3ε蛋白的表达。结果：①转染24小时后,MTT比色法测定各组吸光度值,与未转染组、空载体转染组相比,14-3-3ε转染组A570明显升高(P<0.01)；②Transwell小室实验观察侵袭迁移细胞数目及比较侵袭率,相对于未转染组与空载体转染组,R14-3-3ε转染组侵袭率显著提高(P<0.01)；③平板克隆形成实验中,与其他各组相比,14-3-3ε转染组克隆形成率显著增加(P<0.05)；④流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况,未转染组及空白质粒组凋亡率分别为(6.46±0.45)%和(6.58±0.54)%,14-3-3ε组凋亡率为(2.03±0.17)%,实验组与对照组相比,差异显著(P<0.05)；⑤14-3-3ε蛋白在良性胃黏膜组织中、胃癌组织和转移的淋巴结组织中阳性表达率分别为35.00%(21/60)、72.04%(67/93)、100%(30/30)；⑥14-3-3￡蛋白表达与胃癌的浸润深度,TNM分期,淋巴结转移呈正相关,与胃癌分化程度呈负相关(P<0.05)。结论：14-3-3￡蛋白可增强胃癌SGC7901细胞的增殖、侵袭和迁移能力,减少凋亡。14-3-3ε蛋白与胃癌恶性生物学行为密切相关,有望成为潜在的诊断胃癌、预测胃癌转移、胃癌分化程度、浸润深度及TNM分期的分子靶标。