目的：RCAD (也称为KIAA0776,MLBP,Ufll或Maxer)被认为是类泛素化成员之一Ufm1的E3连接酶,有研究报道RCAD能够调节C53和DDRGK1蛋白稳定性,与NF-kB通路相关,也参与神经退行性变疾病的过程,然而,RCAD在活体和细胞中的生理功能尚不明了。方法：建立RCAD敲基因小鼠和RCAD条件敲基因小鼠,以观察RCAD在小鼠体内的生理功能。发现去除内源性RCAD蛋白导致小鼠严重贫血,随后使用“10种颜色”流式细胞技术(flow cytometry)检测小鼠骨髓造血系统发育,增殖和细胞周期。采用提取小鼠骨髓干细胞体外培养技术模拟小鼠体内造血干细胞生长增殖,以研究RCAD作用机制。运用蛋白免疫印迹技术(western blot)检测细胞中蛋白含量的变化,还有实时定量PCR (qRT-PCR)检测mRNA表达量的差异。用分子克隆相关技术制作shRNA,构建质粒后病毒包装以转染细胞,敲低内源性RCAD表达量或敲入GFP-LC3蛋白。使用细胞免疫荧光染色观察细胞内目的蛋白分布和含量变化。另外我们还使用了电镜观察细胞内详细亚结构。结果：RCAD基因敲除小鼠发生胚胎死亡,解剖不同怀孕时间的母鼠发现RCAD基因敲除小鼠在孕12.5天左右发生死亡。RCAD基因敲除小鼠胚胎和RCAD条件敲除成年小鼠均表现出严重贫血和多核红细胞增多。在使用它莫西分诱导RCAD基因敲除后,多个组织中内源性RCAD蛋白表达量减少,在骨髓细胞中减少最显著。提取小鼠骨髓造血干细胞进行流式细胞仪分析发现RCAD蛋白缺失的造血干细胞(HSC)数量减少,并且单向分化潜能祖细胞(oligopotent progenitor cells)的增殖和分化发生障碍。在骨髓竞争性移植实验中观察到,在野生型受体小鼠中RCAD蛋白缺失的骨髓细胞不能与野生型骨髓细胞竞争。机制研究中发现RCAD蛋白缺失的骨髓造血干细胞生长增殖被抑制并且发生细胞死亡,细胞周期分析结果显示细胞周期被抑制在G1期,不能向S期过度。同时发现RCAD蛋白缺失的细胞中p53活性增高,并且使用p53抑制齐OPFT-α能够有效挽救RCAD蛋白缺失造成的细胞死亡现象。进一步深入探讨RCAD作用机制,发现细胞内损伤线粒体和活性氧堆积,并且在不同组织和小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞中均能观察到自噬体堆积这个表型。接下来我们将这个理论应用于骨肉瘤的研究,实验证明敲低内源性RCAD表达量会导致骨肉瘤细胞株(U20S)中p53升高和自噬体堆积,电镜结果显示在RCAD蛋白缺失的U20S细胞中观察到较多的“不成熟”自噬体。结论：RCAD蛋白缺失严重损伤血液系统发育,在小鼠中导致严重的贫血和血细胞减少症状,并且在多个不同发育阶段均有发育障碍。RCAD蛋白的缺失会影响骨髓干细胞以及其它不同的组织和细胞中的自噬过程,抑制自噬的后期降解过程,造成损伤线粒体和活性氧(ROS)堆积,进而导致细胞启动细胞保护机制,激活P53通路,造成细胞周期抑制和细胞死亡。敲低RCAD表达量同样能够导致骨肉瘤细胞株(U20S)自噬降解被抑制,激活p53通路,发生细胞生长增殖抑制和细胞死亡。本实验结果提示通过药物调节RCAD蛋白表达水平进而调整自噬状态,与其它抗肿瘤化疗药物联合使用也许能够成为有效治疗骨肉瘤新的治疗方案。