论文部分内容阅读
目的1.采用基因芯片技术全面了解大鼠创伤性股静脉血栓形成模型中股静脉基因表达的动态变化;2.筛查出既在创伤即刻呈现差异表达,又在高峰期血栓形成-不形成中呈现差异表达的基因,这些基因可能具有早期诊断的意义,从而为进一步研究深静脉血栓形成的分子机制和建立可用于早期诊断和预后判断的分子标记物提供线索。方法1.造模:将150只SD大鼠随机分为正常对照组(A组,10只)和模型组(140只)。模型组大鼠造模时不麻醉,均采用定量击打双侧大腿+髋人字石膏外固定的方式建立创伤性股静脉血栓动物模型。其中,创伤即刻组(B组)由于造模后即取材而不行石膏固定。造模采用定量击打装置击打双侧大腿外侧各一次后石膏固定,击打部位为股骨大转子下1cm,击打能量为5焦耳。2.分组及取材:根据取材时间和血栓存在状态再将模型组分为以下7组:创伤即刻(B组,造模后0.5h)、血栓形成初始期(C组,造模后72h)、高峰期血栓形成(D组,造模后120h)、高峰期血栓不形成(H组,造模后120h)、血栓消退(E组,造模后168h)、血栓不消退(F组,造模后168h)、血栓不形成(G组,造模后168h)。①血栓存在的状态通过肉眼观察初步判定;②各组取符合相应分组条件的大鼠10余只,腹腔内注射麻醉后,分别切取双侧股静脉及隐大静脉(长约3~4cm)作为标本,其中约0.5cm血管组织用于病理学切片HE染色光镜观察以确定股静脉内是否有血栓存在及分级,最终各组纳入肉眼观察和光镜观察均与分组中相应血栓状态相符的大鼠10只。3.股静脉组织总RNA提取:8组股静脉血管组织同组混合,采用TRIzol一步法提取总RNA,并通过3%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测量其质量,初检合格的RNA样品-80℃保存备用。4.芯片检测:将上述获取的8组RNA样品送往上海国家生物基因芯片工程中心,采用Lab-on质检系统再次确认各组RNA的质量后,按照Genechip Rat Genome230 2.0表达谱芯片操作流程,经cDNA探针制备、生物素标记、杂交、洗脱、染色、扫描完成芯片检测。5.基因芯片的数据处理和分析:①倍数变化分析:通过比较基因表达水平和差异,筛选出各组与正常组比较出现差异表达的基因。筛选标准为上调:SignalLog2 Ratio≥1,且Change标注为I;下调:Signal Log2 Ratio≤-1,且Change标注为D。并对这些基因进行生物学功能分类(GO分类)。②筛选出在创伤即刻组与正常组比较(BvsA)、高峰期血栓形成组与正常组比较(DvsA)中,以及在BvsA、高峰期血栓不形成组与正常组比较(HvsA)中均呈现差异表达的基因;再筛选出其中的显著差异表达基因(筛选标准为:Signal Log2 Ratio≥2和Signal Log2Ratio≤-2),登陆Pubmed数据库查询这些基因的功能。③进一步筛选出BvsA、高峰期血栓形成组与高峰期血栓不形成组比较(DvsH)均呈现差异表达的基因,再采用Gene Cluster 3.0软件对这些基因进行聚类分析。④BvsA和DvsH中均呈现差异表达基因的Pathway分析:登陆KEGG PATHWAY Database数据库查询这些基因所涉及的信号通路,重点分析BvsA、DvsA、HvsA中NEAPK信号通路的变化情况结果1.150只SD大鼠死亡18只,动物死亡率12%。血栓高峰期(造模后120h)D组股静脉血栓发生率50.6%;造模后168h E组血栓消退率56.7%,F组血栓不消退率43.3%,G组血栓不形成率44.6%。2.各组纳入大鼠的股静脉血栓形成状况肉眼观察结果与光镜观察结果基本一致,均符合分组的条件和要求。3.8组RNA样品质检结果:3%琼脂糖凝胶电泳结果示:28SRNA和18SRNA条带清晰,28SRNA:18SRNA>2:1,获取的各组总RNA量均>15μg,能满足芯片检测的要求。4.芯片检测和倍数变化分析结果:在Genechip Rat Genome 230 2.0表达谱芯片(含31 042个基因序列)中:B组与A组比较(BvsA),349个基因出现差异表达,其中,214个上调,135个下调;C组与A组比较(CvsA),2 393个基因出现差异表达,其中1 386个上调,1 007个下调;D组与A组比较(DvsA),1 743个基因出现差异表达,其中945个上调,798个下调;H组与A组比较(HvsA),2 790个基因出现差异表达,其中1 685个上调,1 105个下调;D组与H组比较(DvsH),805个基因出现差异表达,其中51个上调,755个下调;E组与A组比较(EvsA),1 913个基因出现差异表达,其中1 222个上调,691个下调;F组与A组比较(FvsA),2 564个基因出现差异表达,其中1 535个上调,1 029个下调;G组与A组比较(GvsA),1 849个基因出现差异表达,其中1 235个上调,614个下调;5.各组差异表达基因的GO分类结果:差异表达基因的功能大部分不清楚;在已知功能基因中,主要涉及细胞凋亡、分子黏附、代谢、细胞周期、信号转导等方面。6.共79个基因在BvsA和DvsA中均呈现差异表达,112个基因在BvsA和HvsA中均呈现差异表达。其中,19个基因在BvsA,DvsA中均呈现显著差异表达,这些基因的功能涉及炎症应答、免疫应答、急性期反应、趋化因子生物合成的调控、DNA依赖的转录调控等多个方面;18个基因在BvsA,DvsA中均呈现显著差异表达,这些基因的功能涉及纤维蛋白溶解的调控、炎症应答、免疫应答、横纹肌收缩调控、钙离子结合、DNA依赖的转录调控等多个方面。7.共30个基因在BvsA、DvsH比较中均呈现差异表达。这些基因的功能主要涉及细胞凋亡、结合、细胞周期、信号转导、转录调控等。8.对上述30个基因聚类分析后发现,其中21个基因具有相似的临时表达模式:在B、H组中表达均上调,而在D组中无差异表达。这21个基因包括Copeb、Plaur、Serpinel、Ptgs2、Dusp1、Nr4a1、Nr4a3、Junb等基因及7个未知功能基因(RGD:1359581、LOC301105///Syncrippredicted、Dnajb1predicted、RGD1307124predicted、1374429at、1375422at、1383052aat)。这些基因主要涉及纤溶-抗纤溶系统、转录调控、炎症应答、细胞内信号级联放大等多个方面。其中,Serpinel(与抗纤溶作用有关)、Plaur(与促纤溶作用有关)为经典纤溶-抗纤溶系统中的关键基因,Copeb为uPA的转录调控基因,Nr4a1为Serpine1的转录调控基因,Ptgs2为前列环素的合成调控基因(前列环素具有舒展血管和抑制血小板聚集的功能)。根据这些基因的共表达趋势和功能,推测上述7个未知功能基因可能与创伤性深静脉血栓形成有关。8.Pathway分析结果示:上述30个基因涉及MAPK、补体和凝血、黏附斑、TOLL样受体等12条信号通路。其中,MAPK信号通路包含了c-fos、c-jun、nur77等多个与增殖、分化、炎症有关的即刻早期反应基因,这些基因在创伤即刻即呈现高表达。结论:1.具有抗纤溶活性的创伤即刻差异表达基因Serpine 1的变化与高峰期血栓形成密切相关,Nr4a1通过对Serpine 1进行转录层面的调控发挥抗纤溶作用。2.具有纤溶活性的创伤即刻差异表达基因Plaur与高峰期血栓形成密切相关,Copeb通过对尿激酶型纤溶酶原激活剂进行转录层面的调控发挥促纤溶作用。3.Ptgs2、Dusp1、Junb与创伤即刻差异表达的Serpine 1、Plaur、Nr4a1、Copeb共表达,它们可能具有共同的调控元件或相同的细胞来源,在创伤性深静脉血栓形成过程中发挥相似的生物学作用。4.创伤刺激启动MAPK信号通路后,引起c-Jun、c-fos等即刻早期反应基因的表达上调,继而诱发Ptgs2表达上调,增加血管内皮PGI2的合成与释放,从而扩张血管、抑制血小板聚集而发挥抗血栓作用;而Duspl作为MAPK级联反应的内源性抑制物,对该过程发挥负反馈调节作用。5.未知功能基因RGD:1359581、LOC301105///Syncrippredicted、Dnajblpredicted、RGD1307124predicted、1374429at、1375422at、1383052aat与Plaur、Serpinel、Nr4a1、Copeb、Ptgs2、Dusp1、Junb呈共表达趋势,与创伤性深静脉血栓中高峰期血栓形成状态有关,它们在创伤性深静脉血栓形成过程中所发挥的具体机制有待深入研究。6.多个创伤即刻差异表达基因参与MAPK信号通路,表明机体在创伤后即通过转录调控来调节细胞的增殖、分化而开始修复过程。