研究背景：肿瘤细胞的生长和转移依赖新生血管的形成,新生血管不仅为肿瘤细胞的生长提供营养物质与氧,同时也有效的运走其代谢产物,如果没有新生血管的形成就无法满足肿瘤细胞的营养供给及物质排泄,继而严重限制肿瘤细胞的生长和转移。目前抗肿瘤血管治疗已被认为是治疗实体瘤的重要手段,其主要包括血管内介入和抗血管新生药物两种方式。血管内介入是一种有创治疗,主要栓塞肿瘤内的大、中血管,疗效有限,且复发率较高；同样,抗血管生成药物治疗临床应用效果欠佳,总体生存率无明显提高,而且同其他抗肿瘤药物一样,抗血管生成药物也存在耐药现象和毒副作用。近年来的研究发现利用微泡增强的超声空化效应可有效损伤肿瘤组织微血管,造成肿瘤区域灌注缺陷,这使得低强度超声联合微泡有望成为抗肿瘤血管治疗的新手段。然而,在不同的研究中我们发现超声联合微泡对肿瘤组织血流灌注的影响存在差异,有些研究发现在超声联合微泡的治疗下肿瘤组织血流灌注被持续有效的阻断,而另一些研究显示肿瘤组织血流灌注只是短暂受到影响,治疗后逐渐恢复。肿瘤血流灌注持续有效的阻断是超声联合微泡治疗肿瘤疗效的关键,弄清其潜在机制具有重大的临床意义。我们分析造成肿瘤组织血流灌注差异性阻断的主要原因可能是由于各实验中所运用的超声参数不同,对肿瘤组织产生了不同的影响。我们知道超声参数的设置与超声空化效应的强弱密切相关,不同的超声参数对其作用的组织微血管影响不同,从既往的研究中我们也发现在超声联合微泡的作用下肿瘤组织微血管表现出不同的组织病理学改变,有些实验发现超声微泡破坏后肿瘤组织微血管扩张充血,组织间隙水肿,血栓形成,而另一些实验显示肿瘤组织微血管结构遭到明显破坏,组织间弥漫出血。我们推测不同的超声参数通过造成肿瘤组织差异性的病理改变继而对血流灌注产生不同的影响,但是现有的研究由于其所用超声参数单一且没有对血流灌注与组织病理的关系进行研究,不足以证明此猜测,因此还需要进一步的实验去阐明。另外我们还发现,超声联合微泡对肿瘤及肿瘤周围组织的血流灌注影响存在差异。有些实验发现在超声联合微泡治疗后,肿瘤区域血流灌注明显减少,而肿瘤周围组织血流灌注没有明显变化。另一些实验显示,肿瘤及肿瘤周围组织在超声联合微泡治疗后即刻血流灌注均明显减少,但肿瘤周围组织血流灌注在治疗后逐渐恢复。既往的研究发现肿瘤组织微血管较肿瘤周围组织微血管发育不成熟,结构存在缺陷,更易受到机械性的外力损伤,故我们推测肿瘤组织微血管较肿瘤周围组织微血管对超声的空化效应更为敏感是由于其二者之间的血管成熟度差异所致,但是目前的研究还缺乏直接的证据支持,需要进一步的实验去验证。超声联合微泡损伤肿瘤组织微血管的主要机制是超声的空化效应,而超声波的声压又是反映空化效应强弱的最重要的超声参数之一,故我们假设在不同的超声声压下,低强度超声联合微泡通过对肿瘤组织产生不同的组织病理改变继而造成血流灌注的不同影响。另外还我们假设超声联合微泡对肿瘤及肿瘤周围组织灌注的不同影响是由于其二者之间血管成熟度差异所致。研究目的证明我们的假设即在不同的超声声压下,低强度超声联合微泡是通过对肿瘤组织产生不同的组织病理改变继而对血流灌注造成不同的影响,另外,我们还证明超声联合微泡对肿瘤及肿瘤周围组织灌注的影响不同是由于两者的血管成熟度差异导致的。方法：1.实验材料1.1实验动物：健康昆明小白鼠45只,雄性,周龄：6-8周,体重：23-30g,由南方医科大学动物实验中心提供。1.2主要实验仪器：(a)小型脉冲式聚焦超声空化治疗仪：本实验所用设置：治疗探头频率：0.94 MHz,超声发射占空比0.19%,t=1min。脉冲重复频率(PRF)10HZ,其治疗头频率、发射脉冲宽度、超声发射时间、峰值声压、脉冲重复频率等多档可调。由第三军医大学新桥医院超声科提供。(b)超声诊断仪(Sequoia512,德国Siemens公司)：15L8w探头,中心频率7.0MHz,机械指数0.17,配有增强脉冲序列(contrast pulse sequencing, CPS)造影成像技术。1.3主要实验试剂：白蛋白微泡造影剂：成膜材料为白蛋白,核心气体是全氟丙烷,外观呈乳白色凝乳状,微泡平均粒径为2.07±1.13um,浓度约为2.0～4.2×109个/ml,由南方医科大学药学院自行研制。2.实验方法：(一)探索不同的超声声压对肿瘤组织灌注及组织病理学影响2.1动物模型制备：小鼠s180肉瘤细胞,由中山大学细胞研究所提供,取2×106个细胞注入小鼠左侧后腿皮下,种植约7天后待肿瘤直径生长至约10mm左右开始治疗。2.2实验分组：将建成的30只肿瘤小鼠模型随机分为3组,即假治疗组和1.5和3.0 MPa不同超声声压微泡破坏组(每组10只),假治疗组空化超声探头设置关闭以作假照,假治疗组和不同超声声压微泡破坏组均采用尾静脉微泡注入。2.3低强度超声联合微泡空化治疗：用支架固定超声探头,保持探头与肿瘤组织皮肤间距5mm,然后在其相应部位皮肤涂上超声耦合剂凝胶,经尾静脉弹丸式注入O.1ml超声微泡剂后,按上述随机分配的超声声压行超声空化治疗。本实验所用设置：治疗探头频率：0.94 MHZ,脉冲重复频率(PRF) 10HZ,超声发射占空比0.19%,t=1min。2.4 B型超声检查和对比超声灌注显像检查：1.5和3.0 MPa不同超声声压微泡破坏组分别选取5只小鼠在治疗前、治疗后即刻和治疗后24小时对小鼠肿瘤组织区域行B型超声检查和对比超声灌注显像检查。将麻醉好的小鼠斜躺,首先予以B型超声检查(机械指数0.27),然后弹丸式注入0.02m1微泡剂后行对比超声灌注显像(CEU)检查。CEU检查采用二次谐波成像(second harmonic imaging)技术进行,中心频率为7.0MHz,机械指数(Mechanical Index, MI)为0.17。应用MCE软件对超声图像进行分析,采用彩色编码技术制作肿瘤组织显影的彩色编码图像。2.5 HE组织病理学和免疫组化检测：假治疗组、1.5和3.0 MPa不同超声声压微泡破坏组在治疗后即刻和治疗后24小时分别选取5只小鼠将肿瘤组织取出行免疫组化和HE染色。微血管密度测定采用CD31抗体染色标记血管内皮细胞。采用双盲法分别由两位研究者独立地对病理及免疫组化结果进行分析。(二)探索微泡破坏对肿瘤及肿瘤周围组织不同的影响及机制2.6实验分组：对建成的15只肿瘤小鼠模型的肿瘤组织区域及肿瘤组织周围区域行空化治疗,设置超声参数均为3.0 MPa。研究分为肿瘤组织治疗组和肿瘤周围组织治疗组。2.7 B型超声检查和对比超声灌注显像检查：选取5只小鼠分别在治疗前,治疗后即刻和治疗后24小时对其肿瘤组织区域及肿瘤周围组织行B型超声检查和对比超声灌注显像检查,方法同前。2.8 HE组织病理学和免疫组化检测：在治疗前,治疗后即刻和治疗后24小时各选出5只小鼠将肿瘤及肿瘤周围组织取出行HE染色及免疫组化检测。2.9免疫荧光检测：将治疗前和治疗后24小时取出的肿瘤组织及其周围组织行免疫荧光检测。用CD31抗体特异性标记血管内皮细胞,用α-SMA特异性标记外周细胞／平滑肌细胞。如果只被标记CD31抗体,表明血管发育较为幼稚血管。如果同时被标记两种抗体,表明血管发育较为成熟。统计学处理：多重比较时采用单因素方差分析(One-way ANOVA)方法并予以Bonferroni校正,各组数据均以均值±标准差(x±s)表示,P<0.05(双侧)示差异有统计学意义,所得数据使用SPSS17.0统计分析软件进行整理分析。结果：(一)不同的超声声压对肿瘤组织灌注及组织学影响CEU检查结果：两组在微泡注射后超声显影均有明显增强,在3.0 MPa超声声压治疗组,治疗下即刻血流灌注明显减少并在治疗后24小时未能恢复(P<0.05),在1.5MPa超声声压治疗组,治疗下即刻部分区域血流灌注减少(P<0.05),但在治疗后24小时血流灌注较治疗后即刻明显恢复(P<0.05)。HE染色结果：在3.0 MPa超声声压治疗组,治疗后即刻微血管严重破坏,血管管状结构消失,组织间有大量红细胞渗出,在1.5 MPa超声声压治疗组,治疗后即刻微血管可见扩张、充血、组织间水肿同时伴有少量红细胞渗出。治疗后24小时两组渗出的红细胞崩解吸收,在3.0 MPa超声声压治疗组出现大量的肿瘤细胞坏死而在1.5MPa超声声压治疗组肿瘤坏死区域较小。免疫组化结果：免疫组化结果显示在3.0 MPa超声声压治疗组,治疗下即刻微血管结构遭到严重破坏,血管内皮细胞缺失,呈弥散性分布,而在1.5 MPa超声声压治疗组,治疗下即刻肿瘤微血管直径较假治疗组增大。治疗后24小时,在3.0MPa超声声压治疗组微血管密度明显减少与假治疗组相比下降83%(P<0.05),而1.5MPa超声声压治疗组微血管密度下降幅度较小为28%(P<0.05)。(二)微泡破坏对肿瘤及肿瘤周围组织的不同影响及机制CEU检查结果：肿瘤组织及肿瘤周围组织在微泡注射后超声显影均有明显增强,但肿瘤组织在治疗下即刻血流灌注明显减少,部分区域在治疗后24小时未能恢复,而肿瘤周围组织在治疗后即刻血流灌注稍有减少,在治疗后24小时基本恢复。HE染色结果：肿瘤组织在治疗前微血管结构完整,治疗后即刻微血管严重破坏,血管管状结构消失,组织间有大量红细胞渗出,在治疗后24小时肿瘤组织间渗出的红细胞崩解吸收,出现大量肿瘤细胞坏死,而肿瘤周围组织在治疗前血管结构完整,清晰,治疗后血管扩张,充血,组织间水肿,可见少量红细胞渗出,治疗后24小时血管管径基本恢复至正常。免疫组化结果：免疫组化结果显示肿瘤组织在治疗前血管结构形态完整,内皮细胞排列较紧密。但在超声空化治疗后24小时,血管结构遭到严重破坏,血管内皮细胞缺失,呈弥散性分布；肿瘤周围组织在治疗前血管的形态结构完整,内皮细胞排列比较紧密,治疗后24小时大部分微血管结构仍完整,清晰。肿瘤组织微血管密度与治疗前相比明显减少(P<0.05),而肿瘤周围组织微血管密度也有较小程度减少(P<0.05)。免疫荧光结果：共聚焦免疫荧光结果显示大部分肿瘤微血管发育不成熟欠缺周细胞约占89±6%,而肿瘤周围组织微血管与其不同,不成熟微血管约为20±2%。在治疗24小时后,不成熟血管在微血管中所占比例明显降低,尤其是在肿瘤组织中(下降约90%,p<0.05)。成熟微血管与治疗前比较没有显著统计学差异。结论：低强度超声联合微泡运用不同的超声声压造成肿瘤组织微血管的病理改变不同继而对血流灌注产生差异性的影响。另外,超声联合微泡对肿瘤及肿瘤周围组织灌注的影响不同是由于两者的血管成熟度差异导致的