研究背景冠心病(Coronary Artery Disease, CAD)严重危害人民健康,是目前是世界及我国首要致死原因。根据流行病学调查冠心病发病率逐年递增。冠心病的病理基础为动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS),也是导致冠心病病理生理变化的重要原因,随着AS的进展,最终有可能导致管腔狭窄、斑块破裂而引起急性心脏事件危害生命。血管平滑肌细胞(Vscular smooth muscle cells, VSMCs)是构成血管壁的重要组成成分,平滑肌细胞增生、迁移贯穿动脉粥样硬化全过程,因此探讨调节VSMCs生理病理功能,对防治AS具有重要意义。氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein, Ox-LDL)促进AS形成的作用己被大量的研究所证实。目前认为AS形成初期步骤是低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL)进入内皮损伤部位的血管壁,氧化、诱导多种趋化因子,并激活单核细胞分泌不同的生长因子和细胞因子,刺激平滑肌细胞迁移、增殖。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)是具有趋化及活化单核/巨噬细胞作用的重要趋化细胞因子之一,可由内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞产生,血液中的单核细胞在MCP-1作用下发生迁移并聚集在血管内膜下发挥重要的生物学效应如吞噬脂质,形成泡沫细胞。另外,AS的过程中血管平滑肌的增殖也在其形成过程中起到了重要作用,动脉中的血管平滑肌细胞由收缩型转变为合成型,平滑肌细胞从内膜基底部移行入内膜层,而且大量增生并产生胶原纤维和蛋白多糖,最终导致内膜增厚,使病变演变为纤维斑块。在AS病变初期,血管壁细胞数量增多、内膜增厚、管腔变窄,除了与VSMCs过度增殖有关,还与凋亡率下降导致细胞累积、数量增多密切相关。由此可见,MCP-1在AS的发生发展中起到扮演重要角色,提示抑制MCP-1的表达分泌和细胞过度增殖可以作为一个AS治疗的重要靶点。姜黄素(Curcumin)是从姜黄、郁金、莪术等植物中提取的一种中药单体,属于生物多酚化合物,研究显示姜黄素具有抗炎、抗氧化、促细胞凋亡和抑制细胞增殖等药理作用,这些作用理论上可有效拮抗AS的发生与发展,但是其具体作用机制不甚清楚。因此,本研究以VSMCs作为模型,运用现代分子生物学技术,观察姜黄素对Ox-LDL诱导MCP-1表达分泌和增殖,及促凋亡影响,初步探讨其可能的机制。研究目的以大鼠主动脉分离后原代培养的VSMCs为研究对象,运用现代分子生物学技术,如蛋白免疫印迹(Western blot)、逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)、流式细胞术检测等,观察姜黄素对其分泌MCP-1和增殖、促凋亡的影响,探讨其可能的相关机制,进一步揭示姜黄素在心血管药理学方面的分子机制,为姜黄素在心血管疾病治疗上的应用提供理论依据。研究方法第一章姜黄素对Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞MCP-1分泌的影响及相关信号通路的研究取SD雄性大鼠,处死后分离胸主动脉,去除外膜和内膜,按常规组织贴块方法原代培养并传代,实验取用3-8代细胞,免疫组化法通过显示α平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SM-actin)阳性表达鉴定为血管平滑肌细胞。细胞毒性试验：实验分组：1)正常对照组,2)姜黄素(5μM)组,3)姜黄素(1OμM)组,4)姜黄素(20μM)组,5)姜黄素(40μM)组,6)姜黄素(80μM)组；放入孵箱中干预24h,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测存活率,目的是排除在实验范围内引起细胞因子分泌水平减少是由于药物引起细胞数量减少所致的可能；Ox-LDL对大鼠血管平滑肌细胞MVP-1分泌的影响：实验(1)分组：1)正常对照组,2)Ox-LDL (10μg/ml)组,3)Ox-LDL (50μg/ml)组,4) Ox-LDL (100μg/ml)组,干预24h；实验(2)分组：100μg/ml Ox-LDL (0、6、12、24h)作用不同时间作用组。ELISA检测细胞上清中MCP-1的浓度。姜黄塞控制Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞MCP-1表达的影响：实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (100μg/ml)组,3) Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(5μM)组,4) Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(10μM)组,5) Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(30μM)组,通过ELISA和RT-PCR检测细胞上清MCP-1浓度和细胞中MCP-1mRNA表达情况。不促分裂原活化蛋白激酶MAPK (Mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通(JNK, ERK1/2, p38MAPK)抑制剂和核转录因子-κB通路抑制剂(BAY11-7082)对Ox-LDL诱导大鼠血管平滑肌细胞MCP-1分泌的影响响：实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (100μg/ml)组,3) Ox-LDL (100μg/ml)+SP600125(JNK抑制剂)组,4)Ox-LDL (100μg/ml)+PD98059(ERK1/2抑制剂)组,5) Ox-LDL (100μg/ml)+SB203580(p38抑制剂)组,6) Ox-LDL (100μg/ml)+BAY11-7082(NF-κB抑制剂)组,通过ELISA对细胞上清MCP-1进行检测,通过此实验确定引起MCP-1分泌可能被介导的信号通路,为下一个实验提供参考。p38抑制剂(SB203580)和NF-κB抑制剂(BAY11-7082)对Ox-LDL诱导大鼠血管平滑肌细胞磷酸化p38和核内NF-κBp65表达的影响：实验(1)分组：1)正常对照组,2)Ox-LDL (100μg/ml)组,3) Ox-LDL (100μg/ml)+SB203580组；通过Western blot检测磷酸化p38表达水平；实验(2)分组：1)正常对照组,2)Ox-LDL (100μg/ml)组,3)Ox-LDL (100μg/ml)+BAY11-7082组；Western blot检测核内NF-κBp65表达,结合上一实验进一步证实介导的信号通路。姜黄素对Ox-LDL诱导大鼠血管平滑肌细胞磷酸化p38和核内NF-κBp65表达的影响：实验(1)分组：1)正常对照组,2)Ox-LDL (100μg/ml)组,3)Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(5μM)组,4) Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(10μM)组,5) Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(30μM),通过Western blot检测磷酸化p38MAPK表达情况；实验(2)分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (100μg/ml)组,3)Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(5μM)组,4)Ox-LDL (100μ/ml)+姜黄素(1OμM)组,5) Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(30μM),通过Western blot检测核内NF-κB p65的表达情况。第二章姜黄素对Ox-LDL诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及相关机制初步探讨Ox-LDL对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响：实验分组：1)正常对照组,2)Ox-LDL (50μg/ml)组,3) Ox-LDL (100μg/ml)组,4) Ox-LDL (200μg/ml)组,5)Ox-LDL (300μg/ml)组,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测,在酶标仪上测得OD值代表细胞增殖程度；姜黄素对Ox-LDL (100μg/ml)诱导的VSMCs增殖的影响：实验分组：1)正常对照组,2)Ox-LDL (100μg/ml)组,3) Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(20μM)组,4)Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(40μM)组,5)Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(80μM)组,采用MTT检测,在酶标仪上测得OD值代表细胞增殖程度；血红素氧合酶-1Heme oxygenase-1, HO-1)控制剂(ZnPPIX)对姜黄素抑制Ox-LDL诱导VSMCs增殖的影响：实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL(100μg/m1)组,3) Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(80μM)组,4) Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(80μM)+ZnPPIX组,采用MTT检测,在酶标仪上测得OD值代表细胞增殖程度；姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞HO-1mRNA和蛋白表达的影响：实验分组：1)正常对照组,2)姜黄素(20μM)组,3)姜黄素(40μM)组,4)姜黄素(80μM)组,通过RT-PCR和Western blot检测细胞HO-1mRNA表达和蛋白表达的情况；HO-1抑制剂(ZnPPIX对姜黄素抑制Ox-LDL诱导VSMCs增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表达的影响：实验分组：1)正常对照组,2) Ox-LDL (100μg/ml)组,3) Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(80μM)组,4)Ox-LDL (100μg/ml)+姜黄素(80μM)+ZnPPIX组,通过Western blot检测细胞中PCNA表达水平；第三章姜黄素诱导血管平滑肌细胞凋亡的影响的初步探讨姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞凋亡影响：实验(1)分组：1)正常对照组,2)姜黄素(50μM)组,3)姜黄素(100μM)组；通过HOECHST33342细胞染色荧光显微镜观察姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞凋亡形态；实验(2)分组：)正常对照组,2)姜黄素(50μM)组,3)姜黄素(100μM)组,4)姜黄素(120μM)；通过Annexin V-FITC和PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞caspase-8p10的影响：实验分组：1)正常对照组,2)姜黄素(50μM)组,3)姜黄素(100μM)组,4)姜黄素(120μM)组；通过Western blot检测细胞中caspase-8p10表达水平；研究结果一、姜黄素对Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞MCP-1分泌的影响及相关信号通路的研究1)姜黄素在浓度范围(0-80μM)范围内细胞存活率无显著变化：姜黄素加入VSMCs后,与正常对照组比较,5μM组(P=0.634)、10μM (P=0.309)、20μM (P=0.243)、40μM (P=0.202)、80μM (P=0.163)组细胞活性差异无统计学意义。2) Ox-LDL可诱导血管平滑肌细胞分泌MCP-1,在本实验浓度范围呈浓度依赖性：不同浓度(10、50、100μg/ml) Ox-LDL作用于血管平滑肌细胞后,细胞上清中分泌的MCP-1不同程度的增加(P<0.05),并呈浓度依赖性,此实验中在100μg/ml达到最高,故此以后实验均采用100μg/ml浓度进行细胞干预。3) Ox-LDL可诱导血管平滑肌细胞分泌MCP-1,在本实验时间范围呈时间依赖性:将100μg/ml浓度的Ox-LDL作用于血管平滑肌细胞不同时间点(0、6、12、24h)后,检测得细胞上清中的MCP-1不同程度的增加(P<0.05),呈现时间依赖性。4)姜黄素可抑制Ox-LDL诱导血管平滑血细胞MCP-1蛋白表达：将不同浓度的姜黄素预处理,再给予Ox-LDL刺激24h (100μg/ml),与对照组相比,其余各组细胞上清MCP-1明显偏高(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.003)差异具有显著性。与Ox-LDL组单独作用组比较,Ox-LDL+姜黄素(10μM)和Ox-LDL+姜黄素(30μM)组细胞上清中MCP-1明显减低(P=0.000和P=0.000),差异具有显著性。而Ox-LDL+姜黄素(5μM)组和Ox-LDL组单独作用组比较无显著差异(P=0.565)。姜黄素可抑制Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞MCP-1mRNA表达：RT-PCR检测结果显示：与对照组相比,其余各组(Ox-LDL/姜黄素干预组)MCP-1mRNA明显偏高(P=0.000,P=0.000,P=0.001,P=0.024),差异具有统计学意义。与Ox-LDL组单独作用组比较,Ox-LDL+姜黄素(10μM)和Ox-LDL+姜黄素(30μM)组细胞MCP-1mRNA明显减低(P=0.000和P=0.000),差异具有显著性。而Ox-LDL+姜黄素(5μM)组和Ox-LDL组单独作用组比较无显著差异(P=0.054)。5) p38MAPK和NF-κB介导Ox-LDL透导VSMCs表达分泌MCP-1：将不同浓度的姜黄素预处理,MAPK信号通路(JNK, ERK1/2, p38MAPK)抑制剂(SP600125, PD98059, SB203580)或NF-κB抑制剂(BAY11-7082)处理细胞1h,再给予Ox-LDL刺激30min (100μg/ml)。与Control组相比,Ox-LDL单独作用组细胞上清中的MCP-1明显升高,差异具有显著性(P=0.000)。与Ox-LDL组相比,Ox-LDL+SB组和Ox-LDL+BAY组细胞上清中的MCP-1明显降低(P=0.000和P=0.002),差异具有统计学意义；但是,Ox-LDL+SP组和Ox-LDL+PD组与Ox-LDL组无统计学差异(P=0.536和P=0.438),通过此实验确定引起MCP-1分泌可能被介导的信号通路,为下一个实验提供参考。6) Ox-LDL促进p38MAPK磷酸化和核内NF-κB p65表达上调：根据上个实验结果,给予p38MAPK和NF-κB的抑制剂(SB203580和BAY11-7082)预处理细胞1h,再给与Ox-LDL(100μg/ml)组刺激30min。与对照组比较,Ox-LDL组磷酸化p38及核NF-κB p65明显表达增加(P=0.000和P=0.000),差异具有显著性；与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+SB组和Ox-LDL+BAY组中的细胞磷酸化p38和核NF-KBp65的水平明显降低(P=0.006和P=0.006),差异具有显著性。7)姜黄素抑制Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞p38MAPK磷酸化及核内NF-κBp65表达：给予不同浓度姜黄素(5、10、30μM)预处理后,再给予Ox-LDL(100μg/m1)刺激30min。与对照组比较,Ox-LDL单独作用组磷酸化p38表达水平明显升高(P=0.000),差异具有显著性；与Ox-LDL单独作用组比较,姜黄素(10、30μM)+Ox-LDL组可明显下调磷酸化p38(P=0.000和P=0.000),差异具有显著性。Ox-LDL单独作用组与姜黄素(5μM)+Ox-LDL组比较磷酸化p38表达水平无统计学差异(P=0.108)。同样地,与对照组比较,Ox-LDL单独作用组核内NF-KBp65表达水平明显升高(P=0.000),差异具有显著性；与Ox-LDL单独作用组比较,姜黄素(10、30μM)+Ox-LDL组可明显下调核内NF-κBp65(P=0.001和P=0.000),差异具有显著性。Ox-LDL单独作用组与姜黄素(5μM)+Ox-LDL组比较,核内NF-κB p65表达水平无统计学差异(P=0.796)二、姜黄素对Ox-LDL诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖影响及相关机制初步探讨1) Ox-LDL可诱导血管平滑肌细胞增殖：将不同浓度的(50、100、200、300μg/ml) Ox-LDL刺激VSMCs24小时后,与对照组相比,50、100、200μg/ml组OD值明显升高(P=0.015,P=0.009,P=0.035),差异显著,具有统计学意义。2)姜黄素抑制Ox-LDL诱导大鼠血管平滑肌增殖：前面的实验结果已经证实Ox-LDL诱导增殖的效应明显,因此在本实验中我们着重观察姜黄素是否存在对Ox-LDL诱导增殖的抑制效应；给予姜黄素处理细胞,再给予Ox-LDL(100μg/m1)刺激。与对照组比较,Ox-LDL组OD值明显升高,差异具有显著性(P=0.002)。予以姜黄素预处理,Ox-LDL+姜黄素(20μM)与Ox-LDL组比较无统计学差异(P==0.717)。与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+姜黄素(40μM)和Ox-LDL+姜黄素(80μM)组OD值明显降低,差异具有统计学意义(P=0.047和P=0.009)。3)HO-1可能介导姜黄素抑制Ox-LDL所诱导的VSMCs增殖效应：为了观察HO-1是否介导了姜黄素抑制Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖的效应,我们用HO-1抑制剂ZnPPIX、姜黄素单独或共同预处理细胞,再给予Ox-LDL刺激。与对照组比较,Ox-LDL组OD值明显升高,差异具有显著性(P=0.004)与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+姜黄素(80μM)组OD值明显降低,差异具有统计学意义(P=0.016)。与Ox-LDL+姜黄素(80μM)组比较,Ox-LDL+姜黄素+ZnPPIX组OD值明显升高,差异具有统计学意义(P=0.036)4)姜黄素可上调大鼠血管平滑肌细胞HO-1mRNA和蛋白表达：为进一步证实HO-1的介导,用不同浓度姜黄素刺激VSMCs。 RT-PCR结果显示：0μM姜黄素组仍可见微量HO-1mRNA表达(0.14+0.03),与0μM组相比,20μM、40μM和80μM组HO-1mRNA水平明显升高,且差异具有显著性(P=0.006,P=0.000和P=0.006)。与20μM组相比,40μM组HO-1mRNA水平明显升高,且差异具有显著性(P=0.003)。与40μM组相比,80μM组HO-1mRNA水平明显升高,且差异具有统计学意义(P=0.025)。同样地,Western blot结果显示与0μM组相比,20μM和80μM组HO-1蛋白表达水平明显升高,且差异具有显著性(P=0.014,P=0.000和P=0.000)。与20μM组相比,40μM组HO-1蛋白表达水平明显升高,且差异具有显著性(P=0.006)。与40μM组相比,80μM组HO-1表达水平明显升高,且差异具有统计学意义(P=0.000)。以上提示：姜黄素可上调大鼠血管平滑肌细胞HO-1表达,结合上一个实验,认为姜黄素上调HO-1表达介导抑制平滑肌细胞增殖的效应。5)姜黄素抑制Ox-LDL诱导的PCNA表达可被HO-1抑制剂ZnPPIX下调：为了观察姜黄素诱导的HO-1的上调表达是否影响PCNA的表达,我们用HO-1抑制剂ZnPPIX姜黄素单独或共同预处理细胞,再给予Ox-LDL刺激,Western blot检测PCNA水平。结果显示：经Ox-LDL (100μg/ml)处理细胞后,Ox-LDL组PCNA的表达显著上调,差异具有显著性(P=0.000)。与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+姜黄素组PCNA的表达显著下调,差异具有显著性(P=0.000)。与Ox-LDL+姜黄素组比较,Ox-LDL+姜黄素+ZnPPIX组PCNA的表达增加,差异具有统计学意义(P=0.006)。三、姜黄素诱导血管平滑肌细胞凋亡的影响的初步探讨1)姜黄素可诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡：大鼠平滑肌细胞经姜黄素干预之后经Hoechst33342染色,在荧光显微镜下观察：正常对照组VSMCs核呈现蓝色；给予50μM姜黄素处理24h后,可见少量细胞核会致密浓染,呈白色发亮状态；当给予100gM姜黄素处理以后,大量细胞核呈致密浓染,略呈白色。2)流式细胞仪检测进一步证实凋亡情况：与0μM组比较,50μM、100μM、120gM姜黄素组细胞早期凋亡数明显增加,差异具有显著性(P=0.024,P=0.000,P=0.000)。与50μM比较,100μM姜黄素组细胞早期凋亡数显著增加,差异有统计学意义(P=0.000)。与100μM比较,120gM姜黄素组细胞早期凋亡数显著增加,差异也有统计学意义(P=0.016)。3)姜黄素上调caspase-8p10蛋自表达水平：不同浓度的姜黄素(50、100、120μM)对大鼠平滑肌细胞干预以后,与0μM组相比,50μM、100μM和120μM姜黄素干预组caspase-8p10蛋白表达水平明显上调(P=0.043,P=0.001,P=0.000),差异显著。与50μM组相比,100μM姜黄素干预组caspase-8p10蛋白表达水平明显上调(P=0.044),差异显著。与100gM组相比,120μM组caspase-8P10蛋白表达水平也明显上调(P=0.011),差异有统计学意义。结论1)姜黄素在浓度范围(0-80μM)范围内无细胞毒性。2) Ox-LDL诱导大鼠血管平滑肌细胞中p38MAPK的磷酸化及NF-κB入核促进MCP-1分泌表达。3)姜黄素通过抑制p38MAPK和NF-κB信号通路,下调Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞表达分泌MCP-1。4)姜黄素通过上调HO-1的表达,从而下调PCNA的蛋白表达,抑制Ox-LDL诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖。5)姜黄素可诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡,Caspase-8激活有可能是姜黄素诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡的机制之一。