研究背景:肺癌（lung cancer,LC）是世界范围内导致癌症相关死亡率的最主要原因^[1,2]。依据组织学特征来分类,肺腺癌（lung adenocarcinoma,LAC）是LC中最常见的类型。尽管有20%的早期LAC患者可以接受手术,但高达46%的病例在五年内会出现复发和转移,这也是LAC进程过程中的关键限速步骤^[3]。相比此前的观点认为肿瘤的复发和播散只发生在晚期病人身上,越来越多的证据表明在临床症状明显之前即可发生远隔器官的转移。研究发现在同一癌症组织的不同区域,基因表达标记也不完全相同,说明癌症本身的异质性是导致这一现象的一个主要原因。生存压力,比如外科手术和缺氧等可以促发部分肿瘤细胞获得干细胞样免疫表型。针对于癌症干细胞（cancer stem cell,CSC）的精确身份仍有许多争论,主要是因为缺乏一个统一的标记物,并且癌症细胞的免疫表型会随着肿瘤的进程而发生改变。基于生物学行为的多种标记物或分类方法被提出来用于鉴定CSC。侧群细胞（side population,SP）具有排出Hoechst 33342的能力,被认为是一种CSC,它们能分泌ATP结合转录子从而促进药物抵抗的发生^[4]。干细胞还具有一些独特的特征,比如表达高水平的端粒酶和低表达与增殖相关的标记物从而保持静息状态^[4,5]。表达CD133的LC细胞可以增殖并向其他类型细胞分化^[6]。从非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma,NSCLC）中获得的CD44+细胞相比CD44-细胞更具有惰性,同时还表现出CSC的特征,比如在体内和体外再生^[7]。一小部分具有高活性醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1）的LC细胞也表现出CSC的部分特性,如增殖、自我更新和多向分化潜能^[8]。p63是p53蛋白家族中的一个成员,在基底/成体干细胞中常可见到它的表达。此前的研究表明p63对于保持前体细胞池至关重要^[9]。在正常发育过程中,肢芽、支气管和表皮附属器的外胚层表面可以表达p63^[10]。在转基因动物中降低或去除p63的表达会导致上皮发育和形态发生障碍^[11,12]。p63在肿瘤发生、发展过程中的作用仍存争议。多项研究结果支持p63是一种抑癌基因。高表达的p63有助于细胞周期停滞和促凋亡作用^[13,14]。在绝大多数肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma,SCC）中可检测到p63基因组序列的扩增,并与较好的预后相关^[15]。还有许多实质性的证据表明p63可以作为一个原癌基因。p63的调节异常涉及到LAC的进展^[16,17]。因此,p63和其他危险因素之间的相互作用可能会影响肿瘤的发生和发展。多种信号通路涉及到p63相关的干细胞表型调节。在肺发育过程中,Wnt/β-catenin可以维持远端气道上皮细胞增殖和分化之间的平衡^[18]。经典Wnt信号通路激活可以促进支气管肺泡干细胞的扩增^[19]。β-catenin的稳定可以抑制Clara细胞分化并保持自我更新细胞池的稳定^[20]。内源性p63的下调可以增强Wnt相关基因的表达^[21]。然而,在LAC发生和发展过程中p63和Wnt/β-catenin之间的具体作用关系仍不清楚。微环境中Wnt配体的细胞学来源也存有争议。在自稳态维持和肿瘤发生过程中,细胞龛（niche）的组成部分,如成纤维细胞和免疫细胞被认为是Wnts的细胞学来源。免疫细胞是微环境中最重要的调节成分之一,处于从非可控性炎症（non-resolving inflammation）到肿瘤转移这一系列序贯过程的中心。NSCLC分泌高水平的细胞因子/炎症因子来募集髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）,后者主要由两大类亚型细胞构成:分叶核MDSCs(polymorphonuclear MDSCs,PMN-MDSCs,免疫表型CD11b⁺Ly6G⁺Ly6C^lo)和单核MDSCs(monocytic MDSCs,M-MDSCs,免疫表型CD11b⁺Ly6G^-Ly6C^hi)^[22]。与正常人群相比,NSCLC患者体内PMN-MDSCs的数量显著增加^[23]。在晚期NSCLC患者,PMN-MDSCs的扩增与较差的预后有显著相关性,表明它们具有促癌作用^[24]。本课题组最近的研究也表明:骨髓中表达组氨酸脱羧酶（histidine decarboxylase,Hdc）的造血干细胞/前体细胞具有髓系偏向性（myeloid-biased HSC/HSPC,MB-HSC/HSPC）^[25]。在衰老和肿瘤发生等情况下,MB-HSC/HSPC可以作为肿瘤相关髓系细胞的细胞学起源。Hdc⁺未成熟髓系细胞通过直接或间接作用于肿瘤实质细胞,从而调控癌症发生^[10,26]。髓系细胞来源的Wnts也在胃肠道干细胞的再生和分化中发挥重要作用^[27]。本研究中,探讨了p63表达的调节机制和作为预后指标的可能性。临床数据表明大部分表达p63的早期LAC患者更有可能发生复发和转移。Hdc+PMN-MDSCs被募集和浸润在p63⁺癌症细胞周围。Hdc⁺PMN-MDSCs通过上调Wnts的表达来异常激活肿瘤细胞内的Wnt/β-catenin信号通路,并促进p63的表达。本研究的结果进一步揭示了Hdc⁺PMN-MDSCs与LAC细胞之间的作用机制,表明通过靶向策略抑制或去除这些免疫细胞可能有助于抗肺癌治疗。目的:本次研究旨在阐明肿瘤微环境中免疫细胞对肺癌细胞异质性的影响,以及促使后者发生转移的分子机制,以期发现肺腺癌复发和转移的关键调控靶点。为后期基于Hdc+PMN-MDSCs的抗LAC靶向治疗开发提供分子理论依据。方法:1、搜集南昌大学第四附属医院和南昌大学第二附属医院的肺腺癌手术标本蜡块,制作成组织芯片,再通过常规染色和免疫组织化学染色评估和比较肿瘤细胞表达p63的情况;2、构建Hdc-CreER^T2;eGFP;LSL-Kras^G12D小鼠肺癌模型,通过免疫组化和流式细胞术分析LAC组织内MDSCs的构成和数量变化;3、通过免疫组化法观察p63⁺细胞内β-catenin的表达和定位情况,以此初步推断Wnt/β-catenin信号通路异常激活情况;4、通过porcupine^flox/flox和iDTR转基因小鼠,阻断Hdc⁺PMN-MDSCs来源的Wnts合成和分泌或去除所有Hdc⁺免疫细胞,观察体内LAC形成和进展、癌细胞表达p63和Wnt/β-catenin活化情况。结果:1、256例未发生转移的肺腺癌中有46例（18.0%）表达弥漫的胞核阳性p63。2、在p63⁺LAC病例内CD15⁺PMN-MDSCs的数量显著增多,通过LAC转基因动物模型进一步发现,Hdc⁺PMN-MDSCs向p63⁺肿瘤组织聚集并扩增,比例显著增高。3、RNA-Seq和RT-PCR结果表明p63⁺LAC组织内的Hdc⁺PMN-MDSCs高表达多种Wnts,包括Wnt1,2,3和8a。4、通过阻断或者消除Hdc⁺免疫细胞或其来源的Wnts可以显著抑制LAC的进程和p63的阳性率。结论:本研究结果表明MDSCs,特别是Hdc⁺PMN-MDSCs在LAC组织内聚集和扩增,通过分泌高水平的Wnts,以类似旁分泌的形式异常激活临近癌细胞内的Wnt/β-catenin信号通路,促进p63的表达使得肿瘤细胞获得干细胞样特征,这种亚群具有较差预后。该研究为后期基于Hdc⁺PMN-MDSCs的抗LAC靶向治疗开发提供分子理论依据。