论文部分内容阅读
目的：明确三七三醇皂苷（Panax notoginseng，PTS）对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）凋亡的抑制作用，并探讨凋亡相关蛋白Nogo受体（Nogo receptor，NgR）信号通路变化，揭示PTS抑制糖尿病RGC凋亡的机制。材料与方法：论文一：PTS对糖尿病大鼠视网膜RGC凋亡的抑制作用。SD大鼠腹腔注射1%链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液（60mg/kg），72h后尾静脉血糖大于16.7mmol/L即为糖尿病大鼠，动物随机分为对照组，糖尿病组，PTS治疗组。其中PTS治疗组糖尿病大鼠按照50mg·kg-1·d-1的剂量灌胃给药，每天给药两次。1个月后，检测血糖及体重，免疫荧光组化双标检测NgR与RGC特异性标志物Brn3a的共存，Western blot检测视网膜NgR表达变化，试剂盒检测视网膜丙二醛（malonaldehyde，MDA）及谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，HE染色观察视网膜RGC数量。论文二：NgR在糖尿病大鼠视网膜RGC凋亡中的作用。第二部分中的动物饲养、糖尿病动物模型的建立等与第一部分实验相同。动物随机分为对照组，糖尿病组，siNgR组，siRNA空白组。其中siNgR组糖尿病大鼠玻璃体内注射10μl慢病毒包装的NgR反义核苷酸序列5’-AATGACTCTCCATTTGGGACT-3’，siRNA空白组糖尿病大鼠玻璃体内给予10μl慢病毒包装的阴性核苷酸序列。1个月后进行指标检测。检测血糖及体重，以TUNEL染色观察视网膜RGC凋亡，试剂盒检测视网膜MDA及GSH含量，Western blot检测视网膜NgR及caspase-3表达。论文三：PTS通过NgR信号通路参与葡萄糖诱导RGC细胞凋亡。以DMEM+10%FBS培养RGC细胞，细胞培养24小时贴壁后给予不同处理因素，分组培养，即对照组、高糖组（15mmol/L葡萄糖）、siRNA对照组（15mmol/L葡萄糖+阴性核苷酸序列）、siNgR组（15mmol/L葡萄糖+siNgR）及PTS组（高糖+PTS25mg/L）培养的第3天后检测指标，噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞活力；检测MDA及GSH含量变化，观察氧化应激改变； Western blot检测NgR、凋亡相关基因Caspase-3表达变化。结果：1. PTS对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡的抑制作用1.1PTS糖尿病大鼠血糖及体重的影响血糖：STZ腹腔注射后72h，大鼠血糖增高明显，实验用糖尿病大鼠血糖均高于16.7mmol/L，一直维持在高血糖水平，处于糖尿病状态，与对照组相比具有明显的统计学差异（P<0.05），糖尿病大鼠给予PTS对血糖无明显影响，仍处于糖尿病状态，血糖高于16.7mmol/L，PTS治疗组与糖尿病组血糖无明显差异（P>0.05）。体重：对照组大鼠体重增加明显，而糖尿病大鼠体重增长缓慢，较对照组差异明显（P<0.05）。PTS对糖尿病大鼠体重无明显影响，PTS治疗组与糖尿病组体重无明显差异（P>0.05）。1.2NgR与视网膜Brn3a的免疫荧光双标染色Brn3a是RGC的特异性标志物，免疫荧光组化双标染色显示，Brn3a与NgR于视网膜内共存，说明NgR表达于视网膜RGC内。1.3PTS对糖尿病大鼠视网膜NgR表达的影响Western blot显示，糖尿病组大鼠视网膜NgR表达较对照组增加（P<0.05），糖尿病大鼠经PTS治疗组后视网膜NgR表达减少（P<0.05）。结果提示，PTS对糖尿病大鼠视网膜NgR的表达具有抑制作用。1.4PTS对糖尿病视网膜MDA及GSH含量的影响与对照组相比，糖尿病组视网膜MDA含量增加明显（P<0.05），PTS治疗组视网膜MDA含量无明显变化（P>0.05）。与对照组相比，糖尿病组视网膜GSH含量明显减少（P<0.05），PTS治疗组视网膜GSH含量无明显变化（P>0.05）。1.5PTS对糖尿病视网膜RGC数量的影响HE染色显示，糖尿病组视网膜RGC数量较对照组明显减少（P<0.05），而PTS组视网膜RGC数量变化不明显（P>0.05）。2. NgR在糖尿病视网膜RGC凋亡中的作用2.1大鼠血糖及体重变化。血糖：大鼠腹腔注射STZ后72h血糖明显增高，实验中的糖尿病大鼠血糖浓度高于16.7mmol/L，与对照组差异显著（P <0.01）。球后注射siNgR对糖尿病大鼠血糖无明显影响，血糖仍高于16.7mmol/L，siNgR组与糖尿病组血糖无明显差异（P>0.05）。体重：对照组大鼠的体重增加迅速，糖尿病大鼠体重增长较为缓慢，与对照组统计学差异明显（P <0.01）。SiNgR组大鼠体重增长也缓慢，与糖尿病组无明显差异（P>0.05）。2.2视网膜NgR及caspase-3在的表达Western blot检测显示，与对照组相比，糖尿病组和siRNA空白组视网膜的NgR及caspase-3表达增加（P<0.05），而siNgR组NgR及caspase-3表达无明显变化（P>0.05）。2.3NgR对糖尿病大鼠视网膜氧化应激的影响糖尿病组视网膜MDA含量较对照组增加趋势明显（P<0.05），siNgR组视网膜MDA含量较对照组无明显变化（P>0.05）。与对照组相比，糖尿病组大鼠视网膜GSH含量明显减少（P<0.05），siNgR组视网膜GSH含量无明显变化（P>0.05）。2.4NgR对糖尿病大鼠视网膜RGC凋亡的影响TUNEL染色显示，糖尿病组及siRNA空白组视网膜凋亡RGC细胞数量较对照组明显增加（P<0.05）；siNgR组视网膜凋亡RGC细胞数目较糖尿病组明显减少（P<0.05）。3. PTS通过NgR信号通路参与葡萄糖诱导RGC细胞凋亡3.1NgR对高浓度葡萄糖培养的RGC细胞活力的影响与对照组相比，高糖组及siRNA对照组细胞活力下降明显（P<0.05），siNgR组及PTS组细胞活力无明显变化（P>0.05）。与高糖组相比，siNgR组及PTS组细胞活力明显增加（P<0.05）3.2检测MDA及GSH含量变化，探讨氧化应激改变与对照组相比，高糖组及siRNA对照组MDA含量增加均明显（P<0.05），siNgR组及PTS组MDA含量较对照组无明显变化（P>0.05）。与对照组相比，高糖组及siRNA对照组GSH含量均减少（P<0.05），而siNgR组及PTS组GSH含量较对照组无明显变化（P>0.05）。3.3NgR及Caspase-3表达变化与对照组相比，高糖组及siRNA对照组NgR及Caspase-3表达增加明显（P<0.05），siNgR组及PTS组NgR及Caspase-3均无明显变化（P>0.05）。结论：本研究以STZ诱导的糖尿病SD大鼠为研究对象，探讨了PTS对糖尿病大鼠视网膜RGC凋亡的影响及机制，根据实验研究结果，得出结论如下：1. PTS能抑制糖尿病大鼠视网膜RGC凋亡，而且该抑制效应呈血糖非依赖性，即PTS抑制RGC凋亡的作用与血糖无关。2. NgR表达上调是糖尿病大鼠RGC凋亡的重要因素之一，也是PTS抑制视网膜RGC凋亡的重要机制之一。3.氧化应激增强，凋亡相关基因caspase-3表达增加是NgR诱导视网膜RGC细胞凋亡的重要机制之一。4. PTS通过抑制NgR表达，进而抑制了视网膜RGC氧化应激并抑制了Caspase-3的表达，这是PTS抑制糖尿病大鼠视网膜RGC凋亡的重要机制之一。