多花蔷薇根中熊果酸的提取纯化、结构修饰及其生物活性研究

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熊果酸(Ursolic Acid,UA)是一种α-香树脂醇型(α-myrin)五环三萜类化合物,是大多数植物的次生代谢产物,具有多种生物及药理活性,如:抗癌,保肝,降血糖等。目前尚未报道人工合成的UA,大多以植物提取为主要来源。与此同时,UA因其特殊结构,存在生物利用度不高以及医学上的应用被限制等缺点,为此,发现天然产物并且对其进行结构优化对于新型天然药物开发与研究具有重要的意义。本文在对多花蔷薇的生物活性研究过程中,分离纯化得到了UA,并且对UA结构进行了修饰,研究了UA合成物的生物活性。实验结果表明,多花蔷薇根中的UA以及UA的合成物都具有一定抗氧化和抑菌作用。主要研究内容和研究结果如下:(1)建立了紫外-可见分光光度法测定多花蔷薇根中UA含量的方法,选用5%香草醛-冰醋酸和高氯酸作显色剂并优化显色条件,对多花蔷薇根中的UA含量进行了测定。结果表明:548 nm下,在1.6~14.4μg/m L范围内,UA的质量浓度与吸光度线性关系良好,相关系数为0.9998,精密度RSD为1.1%。该方法重现性好,操作简便且快速。利用Box-behnken响应面法优化多花蔷薇根中UA的提取工艺,并利用紫外-可见分光光度法对其含量进行测定,超声-微波提取法在最佳条件下的得率为2.64%,超声-微波酶解协同提取法得率为2.84%,与模型理论预测结果无显著差异。(2)通过不同极性溶剂对多花蔷薇根提取液进行除杂,高效液相色谱跟踪检测除杂过程中UA的损失情况,确定了初步除杂工艺路线,进一步用硅胶柱色谱多次洗脱分离UA粗品,纯度为59.6%。探究了多花蔷薇根中UA的纯化工艺,筛选最佳石油醚脱脂用量和次数、在此基础上筛选活性炭脱色用量和脱色次数,碱沉淀和酸化处理最适p H,经过单因素实验筛选的纯化条件下UA纯度为70.1%。进一步将纯度较高的粗品用葡聚糖凝胶柱色谱分离纯化并重结晶后得到UA纯度为97%以上,利用紫外-可见光谱,红外光谱,1HNMR、13CNMR进行结构鉴定。(3)以UA的母体结构为基础,对其碳三位羟基进行甲酰化修饰,在一定范围内筛选了最佳反应溶剂、反应温度和反应时间,用薄层色谱和红外光谱初步确定UA的羟基被修饰,并对多花蔷薇根中的UA和UA合成物进行体外抗氧化实验(Vc作对照),采用滤纸片扩散法进行了体外抑菌实验。结果表明:反应溶剂为甲酸,温度为50℃,时间为5 h时合成物产率为89.1%。多花蔷薇根中的UA和合成物均有一定抗氧化活性,合成物的OH·清除能力高于Vc和UA;多花蔷薇根中的UA和合成物对枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,变形杆菌,金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用。
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