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第一部分MRI-GRE序列对缺血性脑卒中的诊断价值研究背景:血管中主要成分为脱氧血红蛋白的血栓可以在磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)的梯度回波(gradient Echo,GRE)序列下表现为直径略宽于所在血管的圆形低密度影,称为磁敏感血管征(susceptibility vessel sign,SVS)。SVS征象在区分造成颅内大血管闭塞的血栓成分中可发挥重要作用。孤立脑干梗死的发生机制至今未明,对于合并有颅内大动脉闭塞的孤立脑干梗死的患者来说,早期准确判断血栓成分可以明确病因,并制定针对性的诊疗方案。为此,我们设计了这项临床研究,用以探究MRI-GRE序列检出的SVS征象对患者病因的诊断价值。研究内容:这是一项单中心回顾性病例对照研究,本研究以合并有颅内大动脉闭塞的孤立脑干梗死患者为研究对象,收集年龄、性别、高血压病史、高脂血症、糖尿病史、吸烟史等基线数据,分别由一名神经病学专家及神经影像学专家通过MRI-GRE序列判断SVS。按照缺血性卒中病因的TOAST分型及梗死部位(脑桥梗死,延髓梗死)进行分型。研究方法:通过t检验、U检验及卡方检验,探究SVS征象的与患者卒中分型之间的关系,评价MRI-GRE序列在合并有颅内大动脉闭塞的孤立脑干梗死中的诊断价值。研究结果:从2003年1月到2013年9月,共有213名患者被明确诊断为后循环大血管闭塞,其中有21例发生孤立脑干梗死且符合入组标准。在这21例中,共有9例符合SVS征象的描述,其中2例被证明是血管壁钙化造成的伪影。在卒中分型方面,21例中有2例确诊为房颤,6例为动脉夹层,10例确诊为大动脉粥样硬化,12例确诊为脑桥梗死,9例为延髓梗死。除去伪影的干扰,在明确检出SVS征象的7例中,有2例确诊为房颤,3例为动脉夹层,2例为大动脉粥样硬化性闭塞,3例为脑桥梗死,4例为延髓梗死。统计学分析发现,SVS征象与患者年龄、性别、高血压病史、血脂异常、吸烟是并无相关性。在卒中分型方面,有100%的房颤患者、50%的动脉夹层患者及20%的大动脉粥样硬化性闭塞患者,在其MRI-GRE序列中检出SVS征象。结论:在合并有颅内大动脉闭塞的孤立脑干梗死的患者中,MRI-GRE序列检出的SVS征象可较为准确的反应血栓成分,有助于病因的确定及最佳临床诊疗方案的制定。第二部分不同条件下Fluoxetine对HIF-1α蛋白表达的影响及机制研究背景:缺血性脑卒中为常见的脑血管意外,数十年来致死率居高不下。临床试验发现,对于急性缺血性脑卒中患者连续使用一线抗抑郁药氟西汀(Fluoxetine)治疗数月,可以显著提高卒中患者神经运动功能的恢复,或为改善卒中后运动神经功能康复的最有希望的药物之一。低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是细胞应对低氧环境调控下游基因表达的主要细胞因子,一方面可通过诱导EPO、VEGF、Netrin-1等下游目的基因的表达,发挥促血管生成、调节线粒体转运等一系列作用,从而增强细胞对低氧环境的适应能力,提高细胞活力,维持细胞功能。另一方面,HIF-1α也可通过稳定p53,诱导多种引起线粒体功能障碍的细胞因子发挥促凋亡作用。由于HIF-1α为细胞在低氧环境中发挥生理作用的主要细胞因子,据此我们推测:Fluoxetine的神经保护作用或与其影响神经细胞内HIF-1α的表达密切相关。为此我们设计了以下实验,以期探究不同条件下Fluoxetine对神经细胞内HIF-1α表达的影响及可能的机制。研究内容:本研究以人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞为实验材料,分别探究正常条件下及低氧条件下Fluoxetine对HIF-1α表达的影响。首先通过基因单克隆法构建pc DNA3.0-HIF-1α质粒,通过脂质体转染至细胞中探究正常条件下Fluoxetine是否对SH-SY5Y细胞内源性及外源性的HIF-1α蛋白的表达及衰减产生影响。而后使用氯化钴(Co Cl2)处理SH-SY5Y细胞模拟低氧环境,构建低氧细胞模型,检测低氧环境下不同浓度及不同处理时间下,Fluoxetine对细胞内HIF-1α表达的影响。最后使用免疫共沉淀(CO-Immunoprecipitation,CO-IP)法对目的蛋白HIF-1α进行富集,检测其结合的泛素小分子(Ub)的含量,用以反映其通过泛素-蛋白酶体降解的蛋白水平。研究方法:本实验拟通过基因单克隆法构建pc DNA3.0-HIF-1α质粒;脂质体转染法进行细胞转染;CCK-8及MTT法检测Fluoxetine及Co Cl2的细胞毒性;real-time PCR法检测目的基因HIF-1αm RNA的表达水平;CO-IP法进行目的蛋白HIF-1α的浓缩富集;Western Blot检测目的蛋白HIF-1α的表达水平。并使用Image-J软件系统对目的条带进行定量分析,使用SPSS17.0软件进行数据分析,检测各组差异是否有统计学意义。研究结果:研究结果提示,在外界氧含量正常时,Fluoxetine不影响细胞内源性及外源性HIF-1α的表达。使用Co Cl2诱导细胞低氧时,缺氧6h左右发现Fluoxetine的干预可以通过提高HIF-1α蛋白的泛素化水平促进其降解,显著抑制HIF-1α蛋白在细胞内的累积。随着时间的延长,Fluoxetine对HIF-1α泛素化水平的影响逐渐减低,细胞内HIF-1α含量平稳提升,达到峰值后可继续保持。结论:正常条件下Fluoxetine不影响SH-SY5Y细胞外源性及内源性HIF-1α蛋白的表达及衰减。在低氧环境下与Co Cl2模拟低氧的对照组相比,Fluoxetine可通过提高其泛素化水平而促进其泛素化降解,显著减少不同时间段内HIF-1α的表达,减弱其对低氧刺激的反应能力。