帕金森氏病(Parkinson disease PD)是神经系统常见的变行性疾病之一。主要的病理改变是黑质纹状体通路的多巴胺能神经元变性，导致多巴胺合成减少和乙酰胆碱系统功能亢进。原发性PD的病因与发病机制至今尚不明了。PD患者中存在后天获得性细胞代谢紊乱的现象，提示胰岛素及其信号传导通路障碍。本文旨在通过MPP~+诱导PC12细胞凋亡建立体外PD模型，进而阐明胰岛素是否可以发挥其抗凋亡作用及探讨此可能机制。胰岛素可抵抗MPP十诱导的PclZ细胞的凋亡及其机制研究 在前一部分实验的基础上，应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT一PCR)测定胰岛素受体(insulin reeeptor IR)mRN气的基因表达，应用免疫沉淀Western印迹分析技术测定胰岛素受体的蛋白表达，两者均未发生明显变化。 应用胰岛素受体自身磷酸化的特异阻断剂一HNMPA一AM3再次进行MTT法对细胞生存率的检测实验。观察预加该试剂后.再预加不同浓度的胰岛素及MPP+后细胞生存率的改变，几乎等同于未加胰岛素干预组。结果表明IR磷酸化可能是胰岛素抗MPP+细胞毒的中心环节之一。此可能是胰岛素抵抗MPP+诱导的PC12细胞的凋亡机制之关键。 进一步瞬转野生型人IR质粒于PC12细胞，发现细胞生存率进一步显著提局。 再次对不同实验条件下，IR的基因表达、蛋白表达及磷酸化程度进一步进行研究。结果发现:不同实验条件下，IR的基因表达、蛋白表达均无改变(除外转染细胞);磷酸化程度的变化与细胞生存率的变化有明显相关性。由此可见胰岛素受体磷酸化增加可抵抗MPP+诱导的PC12细胞的凋亡。第三部分磷脂酞肌醇3es激酶/蛋白激酶B是胰岛素受体后信号传导通路控制PC12细胞凋亡的有效途径之一 为了明确磷脂酞肌醇3一激酶(ph。Sphatidylinosito13’一OH kinase，pl一3一K)/蛋白激酶B(protein kinaseB，PKB)是否参与了胰岛素(INS)一INS受体介导的抵抗M即+诱导的Pc12细胞的凋亡作用，本实验选择Wortmannin—P1一3一K的特异性阻断剂抑制PI一3一K的活性。观察应用此试剂后PC12细胞生存率的变化。结果表明:一旦PI3K的激酶活性被阻断，胰岛素的保护作用则基本消失。 应用Western印迹分析技术检测不同实验条件下PKB的蛋白表达量无明显变化，但是PKB的Se尸3磷酸化程度则发生明显改变。证明磷酸化的PKB是胰岛素抵抗MPP+诱导的PC12细胞凋亡的主要抗凋亡分子。 工NS一工NS受体主要通过PI一3一K/PKB的活化导致细胞生物学效应的变化即保护PC12细胞抵抗MPP+诱导的凋亡作用。 结论:1.在50一1000 pM浓度范围内h项PP+浓度越大，对PC12细胞的毒性作用越大。处在同一浓度(300 pM)的MPP十中的PC12细胞时间越长(4小时一24小时)，损害越多。10一100nM胰岛素可以抵抗300 p M MPP+12小时内诱导的PC12细胞的凋亡。2.以上不同实验条件下，胰岛素受体mRNA的基因表达水平、蛋白胰岛素可抵抗MpP+诱导的PC12细胞的凋亡及其机制研究表达水平无明显变化。胰岛素受体自身酪氨酸磷酸化抑制剂一一HNMPA一AM3可以阻断胰岛素的抗凋亡作用。过表达胰岛素受体的细胞株抗凋亡作用进一步增加。胰岛素受体自身酪氨酸磷酸化增加是胰岛素抗MPP+诱导的PC12细胞凋亡的关键。3.Pl一3一K的特异性阻断剂一一Wortmannin可以部分阻断胰岛素的保护作用。不同实验条件下，PKB的Ser473磷酸化程度发生明显改变。磷酸化的PKB是胰岛素抵抗MPP+诱导的PC12细胞凋亡的主要抗凋亡分子。