HSAF（heat-stable antifungal factor）是从生防菌株产酶溶杆菌（Lysobacter enzymogenes）C3中分离得到的多环特特拉姆酸大环内酰胺（Polycyclic Tetramate Macrolactam,PoTeM）类化合物,具有强效广谱抗真菌活性。前期对HSAF的生物合成机制研究发现醇脱氢酶OX4通过延长的迈克尔加成反应催化特定立体构型的5-5双环底物（3-deOH alteramide C）还原环化形成5-5-6三环产物,但仅催化其它立体构型的5-5双环底物（如3-deOH alteramide B）的双键还原而不环化。本研究在前期HSAF生物合成研究的基础上,开展了醇脱氢酶OX4的结构生物学与体外生物化学研究,以期阐明醇脱氢酶OX4的底物立体构型识别机制。通过对OX4重组蛋白的表达纯化、晶体筛选以及X-ray数据收集等实验,首次解析了 OX4蛋白2.3 A的高分辨晶体结构,同时解析了 OX4-NADP（H）二元（3.1 A）及 OX4-NADP（H）-底物 3-deOH alteramideC 三元（3.1 A）复合物结构。我们发现所有结构中OX4均为同源二聚体,每个单体均包含1个核苷酸结合结构域和1个催化结构域,NADP（H）与底物3-deOH alteramide C均结合于2个结构域之间的裂缝处。随后,我们通过点突变体的体外酶活及亲和力测定实验验证了OX4与两者的结合位点。其中,S168和K195残基对NADP（H）的结合发挥关键作用,Y50、D57、D67、T110、F111、M113、F115、W260、Q265、M280、F281、F290和L292残基共同参与底物结合口袋的构建。此外,利用OX4W260F与底物3-deOH alteramide C的体外反应,获得了 1个新的还原产物3-deOH alteramide E。基于OX4与底物复合物的晶体结构和突变体的体外酶活及亲和力研究,我们初步推测了 OX4催化HSAF中6元环形成的分子机制。此外,本研究首次获得了纯度较高且具有体外催化活性的负责HSAF多烯前体合成的iPKS/NRPS全长蛋白,并首次发现了疣孢菌代谢产生邻二烷基取代芳香酸类化合物。综上所述,本研究通过结构生物学与体外生物化学相结合策略,解析了醇脱氢酶OX4的apo结构及2个复合物结构,定位了 OX4中多个关键氨基酸残基,初步推测了 OX4催化成环的“两步”反应机制,为阐明醇脱氢酶OX4的底物立体构型识别机制奠定了基础,为同类酶的催化特性改造提供了理论依据。