杆状病毒主要被用作生物农药来控制农、林业害虫，此外，还被广泛地用作外源基因表达载体，在昆虫细胞中表达大量目的蛋白，同时可作为基因转移载体用于基因治疗。到目前为止，已有45株杆状病毒的全基因组序列被测定，在这些已经测定全基因组序列的杆状病毒中，除了双翅目昆虫杆状病毒--库蚊核多角体病毒(Culexnigripalpusnucleopolyhedrovirus，CuniNPV)外，p48(ac103)基因在其余的昆虫杆状病毒中都存在，说明该基因在杆状病毒系统演化过程中极为保守，暗示其具有重要的生物学功能，但是它的功能并未被揭示。本研究以杆状病毒代表种--苜蓿γ纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV)为研究对象，综合利用Bac-to-Bac系统和ET同源重组的策略，构建了缺失p48基因的重组病毒，探讨了p48基因的缺失对病毒复制的影响，并研究了P48在病毒粒子中的定位，在病毒感染细胞中的表达时相及亚细胞定位。 序列分析发现，AcMNPVp48基因位于AcMNPV基因组88,375nt～89,538nt之间，该基因全长1164bp，编码387个氨基酸，预计编码蛋白的分子量为45.182kDa。在P48蛋白的aa163～179处可能存在一个跨膜结构域，预测该蛋白在膜上的方向可能是N-端朝外。InterProScan分析结果表明AcMNPV的P48蛋白及其同源蛋白构成杆状病毒P48蛋白家族且功能未知。 利用Bac-to-Bac系统和ET同源重组的策略，在大肠杆菌DH10B细胞中成功将AcMNPVBacmid基因组中304-bpp48基因片段替换为氯霉素基因Cm，获得缺失型重组病毒。为了更直接地观察p48基因的敲除可能对病毒侵染所产生的影响，将绿色荧光蛋白基因gfp和多角体基因polh作为标记基因，通过转座作用插入p48缺失型重组病毒的polh位点，获得带双标记的缺失型重组病毒。为了证实p48基因的缺失没有影响到其他基因，同样通过转座作用将其自身启动子控制下的p48基因以及gfp和polh这2个标记基因同时插入到p48缺失型重组病毒的polh位点，获得补回型重组病毒。利用相同的方式获得带有双标记的野生型对照病毒。将这三种带双标记的重组Bacmid分别转染Sf9细胞，显微观察和病毒生长曲线测定结果表明，p48基因缺失型重组病毒不能产生有感染性的芽生型病毒粒子(Buddedvirus，BV)，而p48基因补回型重组病毒产生感染性病毒粒子的能力与野生型病毒无异。为了确定在p48基因缺失型重组病毒中是否产生BV，用核衣壳蛋白VP39的抗体对分离纯化的BV进行Westernblot分析，结果证实p48基因的缺失导致病毒不能产生BV。而实时荧光定量PCR分析结果表明，p48基因的缺失不影响病毒DNA的复制。 为了进一步研究p48基因的缺失是否对病毒粒子的形态发生产生影响，我们分别用p48基因缺失型、补回型和野生型重组BacmidDNA转染的细胞制作了超薄切片，进行电子显微镜观察。在补回型病毒DNA转染的细胞中，观察到的现象与野生型病毒DNA转染的细胞一致。但是，在p48缺失型重组BacmidDNA转染的细胞中，在转染后24h，在细胞核中央可以观察到结构精密的病毒发生基质，以及形态与野生型无异的正常的核衣壳，但是，在细胞质中没有观察到核衣壳，也没有观察到核衣壳正在通过细胞质膜形成BV；在病毒感染晚期，成束的核衣壳聚集在环带区域等待装配，但是观察不到作为包埋型病毒(Occlusion-derivedvirus，ODV)囊膜前体的微囊泡，也没有观察到核衣壳被包裹形成ODV，最终虽然观察到形态、大小正常的多角体，但是多角体中没有包埋病毒粒子。这些实验结果表明，p48基因的缺失不仅影响了BV的形成，并且影响了ODV的形成，并导致多角体中最终没有包埋ODV。 鉴于p48基因的缺失对病毒粒子形态发生的影响，为了确定P48蛋白是否病毒粒子的结构成分，分别构建了在P48蛋白C-端和N-端融合HA-tag的补回型重组病毒，利用融合蛋白上所带标签的抗体进行定位研究。对带有HA-tag的补回型重组病毒进行了P48蛋白在Sf9细胞中的表达时相分析，结果发现在C-端融合HA-tag的重组病毒感染的Sf9细胞中，在病毒感染后12h即可检测到一条43kDa左右的蛋白条带能与HA抗体发生特异性结合，该特异性蛋白的表达一直持续到感染后96h；而在N-端融合HA-tag的重组病毒感染的Sf9细胞中，一直到感染后96h都没有检测到与HA抗体特异结合的蛋白。 用C-端融合HA-tag的补回型重组病毒感染Sf9细胞，纯化病毒粒子BV和ODV，并进一步分别从纯化的BV和ODV中分离出囊膜和核衣壳，然后利用融合蛋白上带有HA-tag的抗体对分离纯化的BV和ODV，以及进一步分离出的囊膜和核衣壳组分进行蛋白免疫印迹分析，结果发现在BV和ODV的囊膜和核衣壳上都能检测到P48蛋白，大小与细胞样品中的一致。蛋白免疫印迹的结果表明，AcMNPVP48蛋白可能同时是BV和ODV的囊膜和核衣壳的结构组分。 为了研究P48蛋白在病毒侵染细胞过程中的亚细胞定位情况，我们构建了能融合表达带有自身启动子的p48基因与gfp基因的重组病毒，并以p48基因启动子启动下单独表达gfp基因的病毒为对照。用构建的重组Bacmid转染的Sf9细胞进行激光共聚焦实验，结果发现在整个感染过程中，融合蛋白在整个细胞中均有分布，但是从病毒感染后16h到72h，融合蛋白较为集中在病毒发生基质处，并且在病毒感染后16至24h，在疑似环带区域处有较为集中的分布。 综合以上实验结果，表明AcMNPVp48基因是病毒复制所必需的，它的缺失导致病毒不能形成BV和ODV，并且最终导致多角体中没有包埋病毒粒子。从蛋白免疫印迹结果推测P48蛋白可能在病毒粒子的囊膜和核衣壳上同时存在。