本文对microRNAs在小鼠内耳发育过程中的差异表达及其对毛细胞分化的作用进行了研究。本文分为四个部分：　　 第一部分：胚胎发育过程中小鼠内耳miRNAs的时空表达特征。　　 目的：毛细胞缺失或损伤是感应神经性聋的主要原因，目前还没有很好的治疗方法。本研究观察不同发育阶段小鼠内耳miRNAs表达特征及变化规律，发现潜在的可能与毛细胞发生和成熟有关的miRNAs。为进一步研究其功能及其对毛细胞再生的作用提供新的线索。　　 方法：提取12个受孕后13.5d(E13.5dpc)、E16.5dpc内耳总RNA，行miRNA芯片检测；收集E8.5dpc、E10.5 dpc、E12.5 dpc、E14.5dpc、E16.5 dpc、E18.5 dpc胚胎内耳以及新生C57BL/6小鼠内耳(P1)，做冰冻切片，原位杂交检测miR-182、miR-194、miR-140等多个重要的miRNA时空表达；提取E13.5 dpc、E16.5 dpc胚胎内耳、新生C57BL/6小鼠内耳(P1)miRNA，qReal-Time-PCR检测miR-194、miR-183、miR-140等多个重要的miRNA。　　 结果：miRNA芯片检测了560个鼠miRNA(sanger miRBase上已注册的鼠miRNA是472个)，与E13.5dpc内耳表达的miRNA相比较，E16.5dpc有1/3表达量有变化，有56个miRNA表达差异在2倍以上。miR-140在耳泡发育期就开始表达，在kolliker器，Corti器，螺旋神经节，前庭上均有表达，后特异性的表达在内外毛细胞，前庭毛细胞和螺旋神经节上。qRT-PCR检测结果证实miR-140在内耳表达逐渐减少。miR-182与miR-140在内耳中表达规律相似。　　 结论：胚胎鼠内耳发育过程中有miRNA的表达，毛细胞分化前后miRNA表达谱改变，提示miRNAs参与了内耳的发育、毛细胞的分化；2)miR-182、miR-140开始广泛表达，最后特异性表达在毛细胞和神经元上，提示他们内耳细胞特化，毛细胞分化过程中有重要作用。　　 第二部分：小鼠内耳前体细胞分离培养及体外诱导分化模型建立。　　 目的：体外研究耳蜗毛细胞分化及调控机制，对毛细胞再生的研究具有重要启示。目前世界上还没有建立可以稳定传代的非转基因哺乳动物毛细胞或其前体细胞系。本文体外分离、原代培养小鼠耳泡细胞，建立耳泡细胞原代培养体系，并探讨诱导分化的方法，为研究毛细胞再生机制提供重要细胞模型。　　 方法：取孕后11.5d(E11.5dpc)C57BL/6胚胎，分离出耳泡，小心剔除周围组织。胰酶消耗，37℃培养。7天后用分化培养基培养，诱导细胞分化7天。收集分化和未分化细胞，RT-PCR检测干细胞/毛细胞前体细胞、毛细胞标记分子。免疫荧光检测myosinⅡⅤa，Math1，Jagged2，p27kip1，F-actin。　　 结果：耳泡体外培养3天后可以形成2种球，一种是实体球，一种空心球。RT-PCR显示未分化的细胞主要表达Abcg2，nestin等干细胞Marker，分化后的细胞表达math1，myosinⅡⅤ a等毛细胞分子标记物。免疫荧光结果同样证实，细胞分化后表达math1，myosinⅡⅤ a等毛细胞分子标记物。电镜观察细胞，可见细胞表面呈Ⅴ型的纤毛样结构。结论：哺乳动物毛细胞的体外培养和建系是目前世界性难题。本研究证实耳泡(内耳的干细胞)可以体外培养，采用适当的方法，可以诱导出表达特异性毛细胞标志分子的细胞。提示该体系是可以同时研究毛细胞再生的分子机制和毛细胞功能获得的重要模型。　　 第三部分：miRNA-183家族成员载体的构建及靶基因预测。　　 目的：构建鼠miR-183家族重组腺病毒，构建miR-183家族靶基因载体，通过双荧光素酶报告系统验证miR-183家族成员的靶基因。　　 方法：从C57BL鼠肝脏中提取基因组DNA，扩增包含miR-183家族成员的PCR产物，并定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将经pm eⅠ线性化的重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183，通过同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-miR-182、pAd-miR-183、pAd-miR-96。将pAd-miR在人胚肾293细胞(HEK293)中包装并扩增出pAd-miR的重组腺病毒。从基因组DNA中扩增预测靶基因3UTRPCR产物，定向插入pRL-TK载体。用pAdTrack-CMV-miR、pRL-TK-utr、pGL-ctl共转染COS2细胞，双荧光素酶法检测双荧光强度。　　 结果：限制性内切酶分析和DNA测序结果显示，重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-miR构建正确，pRL-TK-utr构建正确。在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-183、rAd-miR-182、rAd-miR-96。双荧光素酶报告系统证实Tbx1是miR-182的一个靶基因。　　 结论：成功构建了rAd-miR-183、rAd-miR-182、rAd-miR-96重组腺病毒，成果构建了pRL-TK-utr载体，并用双荧光素酶报告系统证实Tbx1可能是miR-182的靶基因之一，为深入研究miR-183家族在内耳中的功能和机制创造条件。　　 第四部分：miR-182对内耳干细胞分化影响及靶基因鉴定。　　 目的：研究miR-182对体外培养的内耳前体干细胞分化的影响，并探讨其可能存在的机制。　　 方法：qRT-PCR法检测内耳前体干细胞诱导分化前后miR-182表达，转染miR-182重组腺病毒、miR-182抑制剂，观察其对内耳前体干细胞分化的影响，荧光免疫法检测转染前后Tbx1表达量。　　 结果：内耳前体干细胞增殖期miR-182表达量改变不明显，诱导分化后mR-182表达量明显增加。miR-182重组腺病毒促进毛细胞分化，Tbx1表达明显减少，miR-182抑制剂抑制毛细胞分化，Tbx1表达量增加。　　 结论：外源性miR-182促进毛细胞分化，Tbx1可能是miR-182的靶基因。讨论：外源性miR-182促进毛细胞分化，与内耳前体细胞分化过程中miR-182表达增加结果相一致，提示miR-182具有促进内耳前体干细胞分化为毛细胞的功能。高表达或抑制miR-182表达致Tbx1表达改变与我们预测验证的结果相一致，但是miR-182是否是通过调控Tbx1来调控毛细胞分化的需要进一步研究。