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前言 内皮细胞通过释放血管活性物质调节血管张力，随年龄的增加，血管内皮功能受损，但其在衰老过程中所起的作用及机制尚不清楚，目前认为可能是与血管内皮对于血管活性物质反应的改变有关。内皮细胞可以产生一种血管活性物质(Endothlium-derived relaxing factor, EDRF)，导致平滑肌细胞舒张。现已证实了EDRF的化学本质是一氧化氮(Nitric oxide, NO)或相关的亚硝酰基化合物，是主要的内源性舒血管物质。NO是由一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)催化L-精氨酸转化而来。目前认为随年龄的增加，血管内皮舒张功能将会降低，而其中起最主要作用的是NO，因此深入研究NO在衰老进程中的变化及所起的作用，无疑对揭示衰老的机制具有重要意义，并可能为临床抗衰老的防治和新药的开发提供新的思路。目前对于在衰老时NO变化情况的研究结果不尽相同，本实验拟通过乙酰胆碱(Ach)、一氧化氮合酶抑制剂(N~G-nitro-L-arginine, L-NNA)、NO前体(L-arginine, L-Arg)等药物对衰老大鼠离体主动脉环血管内皮依赖性舒张反应的测定，来观察年龄对血管内皮功能的影响，同时通过免疫组织化学方法，观察eNOS和iNOS在不同年龄组大鼠主动脉的表达，以便更直观、更确切地反映NO系统的变化，旨在探讨NO/NOS系统与衰老的发生、发展之间的可能作用及其机制。 实验材料 1．实验动物 Wistar大鼠，成年组，老年组各20只 2．主要试剂 N－硝基－L－精氨酸上－精氨酸、去甲肾上腺素、乙酚胆碱 S朋c免疫组化试剂盒，兔抗大鼠诱导型一氧化氮合酶的多克隆抗体、兔抗大鼠内皮型一氧化氮合酶的多克隆抗体。 3．主要仪器 组织器官水浴系统、台式自动平衡记录仪、图象数码摄像仪，图像处理仪、酸度计、切片机，光学显微镜。 实验方法 1．血管张力测定研究 Wistar大鼠，成年组，老年组各川只，苯巴比妥钠N0m吵吨）麻醉，取降主动脉段，置于盛有Krebs营养液的培养M中，仔细分离血管周围组织，剪成长约3—4mm的动脉环。分别将两个0．lmm的不锈钢丝穿人动脉环，作成三角环状，随后置于 37℃的恒温水浴槽内，通过平衡记录仪记录血管环的张力变化。实验中持续给以 95％的氧和 5％的H氧化碳混合气。经30分钟平衡后，每个血管环用去甲肾上腺素（NE，2 x 10刁 moVL）预收缩，达最大收缩状态再分别加人乙酚胆碱水－硝基－L－精氨酸上一精氨酸等药物记录动脉环的张力变化。 2．免疫组织化学研究 Wistar大鼠，成年组，老年组各 10只，苯巴比妥钠N0m矿kg）麻醉，取降主动脉Zcm左右，投于4％多聚甲醛固定液中固定2天，常规脱水、透明、石蜡包埋。5 pm厚切片，用于免疫组织化学染色。免疫组化采用常规S邓。法。切片组织细胞的胞浆内有棕褐色颗粒沉着为阳性反应。用摄像仪采集图像。于光镜下（X400）每组随机取3张切片，每张切片随机选取3个视野。用图像处理软件分析各组间大鼠主动脉eNOS和iNOS免疫产物的相对含量，以灰度值表示。 3．数据处理 ·2· 采用 SPSS10．0统计软件分析数据。全部实验数据以均数 L标准差k S）表示，两均数间比较采用 t检验，P＜0．05为差异显著性，P叩．of为差异极显著性。 实验结果 1．血管活性物质对离体血管张力的影响 二．l 内皮细胞完整的大鼠离体主动脉环用 2 x 10刁 moVLNE预收缩，可见两组大鼠主动脉环的收缩状态无明显区别，均可以维持于收缩状态。 二．2 NE预收缩后，水浴槽中累积性加人不同浓度的人Ch，可诱发剂量依赖性血管舒张反应。表明老年和成年大鼠离体主动脉环经NE预收缩后，内皮细胞可以通过ACh介导，引起血管舒张反应。同时显示老年组大鼠主动脉环对 10Jl0一 mol／L Ach诱发的内皮依赖性血管舒张反应均较成年组明显减弱，两组之间有显著差异（P＜0．01）。 1．3 L－NNA对ACh诱发的老年大鼠主动脉环内皮依赖性舒血管反应的影响。内皮细胞完整的大鼠离体主动脉环标本经川’‘mol／L L－NNA预处理20min，阻断NOS后，同样剂量的 Ach不再诱发上述内皮依赖性舒血管反应。表明ACh介导的上述血管舒张反应与内皮细胞合成NO有关。 l．4．在L－挪及L－NNA预处理后对ACh诱发的老年大鼠主动脉环内皮依赖性舒血管反应的影响。内皮细胞完整的大鼠离体主动脉标本在10J moVL L－Arg和 10一 mo卜L L－NNA预处理20alln后，10－卜10－‘moVL Ach可以部分恢复对老年组和成年组大鼠离体主动脉环内皮依赖性舒血管反应。表明L－精氨酸在L－NNA存在的情况下，可以在一定程度上恢复老年组和成年组离体大鼠主动脉环对乙酚胆碱诱发的内皮依赖性血管舒张反应，但两组之间差异无显著性汗＞0．oj人 ·3· 2．leNOS的兔疫组化染色结果：光学显微镜下，成年组大鼠主动脉血管内皮层可见棕褐色的阳性反应颗粒广泛沉着，颗粒主要集