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脂肪酶(Lipase,EC.3.1.1.3)是一类特殊的酯键水解酶,也是最早研究的酶类之一,脂肪酶具有很强的底物特异性及功能多样性,在洗涤剂、食品与饲料、纺织、造纸、化工及医药等工业领域得到了广泛的应用。本研究从源自南非的极端丝状真菌中筛选对不同碳链长度的底物有不同酶活力的产脂肪酶菌株,对其脂肪酶基因进行克隆并在毕赤酵母中表达,且对重组酶的酶学性质进行了分析,具体研究内容以及结果如下。(1)本文选用罗丹明B平板法和滴定法,从源自南非的106株嗜碱丝状真菌和53株嗜热丝状真菌中分别筛选得到56株和22株具有脂肪酶活性的菌株,经ITS分子生物学鉴定后分属于19个属,32个种。(2)对筛选得到的78株产脂肪酶菌株进行水解底物的特异性分析,选取4种不同碳链长度(C4-C16)的对硝基苯酚酯作为底物,利用分光光度法从中筛选到4株对不同底物水解活力呈明显差异性的菌株。其中,Mucorcircinelloides F4-95分泌的脂肪酶以对硝基苯酚月桂酸酯(pNPC12)为底物的酶活力明显高于其它底物,且与其亲缘性相近菌株的脂肪酶基因均未被异源表达,因此,选取该菌株做进一步的脂肪酶基因功能性研究。(3)通过PCR技术扩增卷枝毛霉(M.circinelloides)F4-95脂肪酶基因lipA lip B,构建重组质粒pPIC9K-lip A和pPIC9K-lip B,获得重组酵母GS-Lip A和GS-Lip B,在30℃、200 r/min条件下,0.5%(v/v)甲醇诱导发酵120 h,以对pNPC12为底物,Lip A、Lip B 酶活力分别为 14.34 U/mL、21.66 U/mL。(4)对重组酶的酶学性质进行分析,Lip A的最适温度和最适pH分别为40℃、pH 8.0,金属离子Na+、K+明显提高了重组酶活力,而Co2+、Cu2+强烈的抑制了重组酶活性。Lip B的最适温度和最适pH分别为30℃、pH 7.5,金属离子K+明显提高了重组酶活力,而抑制作用相对于LipA较小,其中Cu2+的抑制作用最强。两组重组酶对pNPC12酶活力均为其他碳链长度底物的2-5倍,且Lip B酶活力高于Lip A,因此,Lip B对脂肪酶的底物特异性作用较强。